一、直接診斷和間接診斷
基因診斷可分為兩類:一類是直接檢查致病基因本身的異常。它通常使用基因本身或緊鄰的DNA序列作為探針,或通過PCR擴增產(chǎn)物,以探查基因無突變、缺失等異常及其性質(zhì),這稱為直接基因診斷,它適用已知基因異常的疾;另一類是基因間接診斷。當(dāng)致病基因雖然已知但其異常尚屬未知時,或致病基因本身尚屬未知時,也可以通過對受檢者及其家系進行連鎖分析,以推斷前者是否獲得了帶有致病基因的染色體。連鎖分析是基于緊密連鎖的基因或遺傳標(biāo)記通常一起傳給子代,因而考察相鄰DNA是否傳遞給了子代,可以間接地判斷致病基因是否傳遞給子代。連鎖分析多使用基因組中廣泛存在的各種DNA多態(tài)性位,特別是基因突變部位或緊鄰的多態(tài)性位點作為標(biāo)記。RFLP、VNTR、SSCP、AMP-FLP等技術(shù)均可用于連鎖分析。
二、基因異常與診斷方法的選用
各種遺傳病的基因異常是不同的,同一遺傳病也可以有不同的基因異常,但這些異常大體可分為基因缺失和突變兩大類型。后者包括單個堿基置換、微小缺失或插入。近年來不發(fā)現(xiàn)一些遺傳病是由于基因內(nèi)的三核苷酸重復(fù)順序增加引起的,根據(jù)對基因異常類型的了解,可以采用不同的診斷方法(表13-2)。如基因缺失可用基因探針雜交,PCR擴增直接檢測;點突變可用等位基因特異的ASO探針、SSCP等直接檢查。一般無需對家系成員進行分析。但條件是必需知道基因異常的性質(zhì),并肯定該異常與疾病之間的關(guān)系。然而,由于許多疾病的遺傳異質(zhì)性,以及多數(shù)遺傳的基因異常尚屬未知,目前能直接診斷的病種雖日益增多,但仍然是比較有限的。
表13-2 遺傳的基因診斷方法
基因異常 | 方法 | 探針、引物或限制酶 |
基因缺失 | 基因組DNA印跡雜交
PCR擴增 |
缺失基因的探針
引物包括缺失或在缺失部位內(nèi) |
點突變 | RFLP分析
ASO雜交 PCR產(chǎn)物的多態(tài)性分析 (RFLP、SSCP、DGGE) |
突變導(dǎo)致其切點消失的限制酶
正常和異常的ASO探針 引物包括突變部位 |
基因已知但異常不明 | 基因內(nèi)或旁側(cè)序列多態(tài)性(RFLP、AMP-FLP,SSCP)連鎖分析 | 基因內(nèi)或旁側(cè)序列探針或引物 |
基因未知 | 與疾病連鎖的多態(tài)性,如SSCP、AMP-FLP連鎖分析,RFLP位點單體型連鎖分析 | 與疾病連鎖的多態(tài)位點探針或引物 |
許多遺傳病的基因尚未分離克隆,或基因異常尚不清楚,因此還不能根據(jù)突變的性質(zhì)進行診斷。但如果通過家系分析能證明某一DNA標(biāo)記(無論是等位基因還是多態(tài)性位點或片段)與致病基因連鎖,則凡帶有該標(biāo)記的成員都可能帶有致病基因,從而可作出間接的連鎖分析診斷。
應(yīng)用連鎖分析診斷時應(yīng)注意如下幾個問題:①基因與DNA標(biāo)記之間可能發(fā)生重組。因此連鎖分析的準(zhǔn)確性取決于DNA與致病基因連鎖的緊密程度,連鎖愈緊密,可靠性愈高,故應(yīng)采用盡量靠近致病基因,即連鎖緊密的標(biāo)記,或采用多個遺傳標(biāo)記以盡可能排除重組。由于可能存在重組,連鎖分析不能完全確定致病基因是否存在,而是指出存在可能性或概率的大小。如果標(biāo)記距基因有5cM,即重組率為5%,則作出診斷時尚有5%誤差的可能,即只有95%的把握作出肯定或否定的結(jié)論。②選用的遺傳標(biāo)記在人群中的雜合度。如果標(biāo)記的雜合度在人群中很低,即多數(shù)個體為純合子,則這種標(biāo)記用處不大。因為如家系中關(guān)鍵成員不能提供致病基因在哪一條染色體上的信息,常使連鎖分析無法進行,因此需選用人群中雜合度高的標(biāo)記。③在連鎖分析時,有時只分析一個多態(tài)位點還不能把某一家系中帶有致病基因的染色體與正常染色體區(qū)分開來。這通常是由于關(guān)鍵成員如待診者的父母是純合子,不能提供必要的信息,這時可同時分析更多的多態(tài)位點,即作單倍型(haplotype)分析。單倍型是指一條染色體上兩個或兩個以上多態(tài)位點的狀態(tài)的組合。兩條染色體多個位點上都純合的概率畢竟是很小的,因此單倍型有助于區(qū)分兩條常染色體,并追蹤致病基因的分離情況。
三、遺傳病的基因診斷舉例
1.基因缺失型遺傳的診斷
。1)α地貧的基因診斷:α地貧主要是由于基因缺失引起的,缺失的基因可以由1-4個。正;蚪M用BamHⅠ切割,可以得到一個14kb的片段,而缺失一個α基因時切點向5’端移位,得到一條10kb的片段。因此,當(dāng)用α基因探針與基因組DNA進行Southern雜交時(圖13-8),在α地貧2可見一條14kb和一條10kb的帶,在正常人可見一條雙份的14kb的帶,而在α地貧1則見一條單拷貝的14kb帶,血紅蛋白H病時只有一條10kb的帶的,而在Barts水腫胎時,則無任何雜交帶。
圖13-8 α地貧基因缺失的診斷
左圖:16號染色體上攜有數(shù)目不同的基因
右圖:α基因探針雜交的結(jié)果
箭頭:BamHⅠ切點
一種較簡便的方法是直接用α探針進行斑點雜交,自顯影后根據(jù)斑點深淺的不同也可以對α地貧作出診斷。更為簡單的方法是PCR診斷,即在α基因缺失范圍內(nèi)設(shè)計一對引物,然后PCR擴增胎兒的DNA,如為Barts 水腫胎,則無擴增產(chǎn)物,電泳后無任何帶紋,從而可建議進行人工流產(chǎn),但此法不能診斷其它類型的地貧(除非另設(shè)計引物用作PCR)。
。2)DMD/BMD的缺失型診斷:DMD/BMD是一種Ⅹ連鎖隱性遺傳的神經(jīng)肌肉系統(tǒng)受累的致死性遺傳。▍㈤喌谒恼)。DMD/BMD有70%左右為缺失型。此基因很大,缺失可發(fā)生在不同部位,因此應(yīng)盡可能采用多對引物作PCR擴增(多重PCR)來檢測。如擴增產(chǎn)物電泳后發(fā)現(xiàn)有帶紋的缺失,即可作出診斷并對缺失定位(圖13-9),在進行產(chǎn)前診斷時,一般可先通過檢測家系中有關(guān)成員,即確定先證者的缺失區(qū),然后有針對性地作PCR擴增,包括缺失部分的兩端,以判斷胎兒或有關(guān)患兒是否也獲得了相同的基因缺失,但非缺失型不能用此法查出。
2.點突變型遺傳病的基因診斷2
。1)鐮形細(xì)胞性貧血的基因診斷:已知突變基因是編碼β珠蛋白鏈的第6位密碼子由GAG變?yōu)镚TG,從而使纈氨酸取代了甘氨酸,因此可用如下方法進行診斷。
圖13-9 DMD基因缺失的多重PCR診斷
exon:外顯子;pm:啟動子;1:正常9條帶;2:基因全缺失;3:啟動子區(qū)缺失;4:第3外顯了缺失;5:第13外顯子缺失;6:第47外顯子缺失;7:47-52外顯子區(qū)段缺失;8:第52外顯子缺失
1)RFLP診斷:已知限制酶MstⅡ切割的識別順序是CCTNAGG,它能切割正常β鏈中CCTGAGG序列,但不能切割突變了的CCTGTGG(A→T)。這樣,由于突變消除了一個切點,使內(nèi)切酶長度片段發(fā)生了改變,通過電泳,就可以區(qū)別正常的βA和βS(圖13-10)。
圖13-10 鐮狀貧血的基因診斷
除MstⅡ外,限制酶DdeⅠ(識別序列為CTNAG)也能夠把正常的βA基因與鐮變了的βS基因區(qū)別開來,并用于診斷。
2)ASO探針診斷:由于突變部位和性質(zhì)已完全明了,也可以合成寡核苷酸探針,用32P標(biāo)化來進行診斷。此時需要合成兩種探針,一種與正常βA基因序列完全一致,能與之穩(wěn)定地雜交;另一種與突變基因序列一致,能與βS基因穩(wěn)定雜交,但不能與正常的βA基因雜交。根據(jù)雜交結(jié)果,就可以把發(fā)生了突變的βS基因檢測出來。
PCR技術(shù)問世以來,ASO診斷又有新的改進,即先PCR擴增長約110bp的基因片段,然后再與ASO探針雜交。這樣可減少目的基因DNA用量,并降低與基因組DNA雜交時的非特異性信號。
3.基因異常不明的遺傳病的診斷
成年型多囊腎病(adult polycystic kidney disease,APKD)是一種常染色體顯性遺傳病,發(fā)病率高,約1000人中有1名致病基因的攜帶者,起病較晚,多在30歲以后,主要為腎和肝中出現(xiàn)多發(fā)性囊腫,臨床表現(xiàn)為腰疼、蛋白尿、血尿、高血壓、腎盂腎炎、腎結(jié)石等,最終可導(dǎo)致腎功能衰竭和尿毒癥。本病基因定位在16p13,與α珠蛋白基因3’端相鄰,但致病基因尚未克隆,基因產(chǎn)物的生化性質(zhì)和疾病發(fā)病機理也尚未闡明。因此,目前只能用連鎖分析來進行基因的發(fā)病前診斷和產(chǎn)前診斷。由于通過家系分析,已證實APKD的致病基因與α珠蛋白基因3’端附近的一段小衛(wèi)星DNA序列即3’HVR(3’ hypervariable region)緊密連鎖,而后者在人群中具有高度多態(tài)性,因此可以通過RFLP連鎖分析進行診斷(圖13-11)。
圖13-11 成年型多囊腎病的連鎖分析診斷
從圖13-11可見,當(dāng)用3’HVR作為探針與PvuⅡ酶切后的家系有關(guān)成員基因組DNA雜交時,可見有5.7、3.4和2.4kb的3種等位片段。患者的母親有5.7和3.4kb兩種片段,父親為2.4kb純合子,其子女凡有3.4片段者為患者,而凡無此片段者都不是患者。因此可知致病基因伴隨3.4kb等位片段分離,即與之相連鎖。圖中Ⅱ5的DNA檢查只有5.7和2.4kb而無3.4kb片段,故不是患者或致病基因攜帶者。