抗原的制備

　�。ㄋ�)抗原的分離與純化

　　從細(xì)胞中提取出來的生物大分子是不純凈的，必須進(jìn)一步分離純化才能獲得純品。在生物大分子制備工作中，分離純化是比較復(fù)雜和重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。對(duì)于異類的物質(zhì)，如提純蛋白質(zhì)和酶時(shí)混雜著核酸，提純核酸時(shí)混雜著蛋白質(zhì)或多糖，一般可用專一性酶水解、有機(jī)溶劑抽提、選擇性分部沉淀等方法處理，小分子物質(zhì)常在整個(gè)制備過程中多次液相與固相互相轉(zhuǎn)化被分離或最后用透析方法除去。而對(duì)同類物質(zhì)，如酶和雜蛋白，RNA和DNA以及不同結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)、酶、核酸之間的分離，情況則復(fù)雜得多，主要應(yīng)用的方法有鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法、吸附法、結(jié)晶法、電泳法、超速離心法、柱層析法等。其中鹽析法、等電點(diǎn)法、結(jié)晶法用于蛋白、酶的提純較多；有機(jī)溶劑抽提和沉淀用于核酸提純較多；柱層析法、梯度離心法在蛋白質(zhì)和核酸的提純工作中應(yīng)用均十分廣泛。本節(jié)　側(cè)重對(duì)蛋白質(zhì)、酶和核酸分離純化中與溶解度有關(guān)的一些方法作一簡要敘述。

　　1．蛋白質(zhì)分離純化的一些方法

　　（1)鹽析法

　�、僭�理：鹽析法對(duì)于許多非電解質(zhì)的分離純化都是適合的，也是蛋白質(zhì)和酶提純工作應(yīng)用最早，至今仍廣泛使用的方法。其原理是蛋白質(zhì)、酶在低鹽濃度下的溶解質(zhì)隨著鹽液濃度升高而增加（此時(shí)稱為鹽溶)；當(dāng)鹽濃度不斷上升時(shí)，蛋白質(zhì)和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出，稱為蛋白質(zhì)的鹽析。這一現(xiàn)象是由于蛋白質(zhì)分子內(nèi)及分子間電荷的極性基團(tuán)有著靜電引力，當(dāng)水中加入少量鹽類時(shí)，由于鹽類離子與水分子對(duì)蛋白質(zhì)分子上的極性基團(tuán)的影響，使蛋白質(zhì)在水中溶解度增大。但鹽濃度增加到一定程度時(shí)，蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和，水化膜被破壞，于是蛋白質(zhì)就相互聚集而沉淀析出。鹽析法就根據(jù)不同蛋白質(zhì)和酶在一定濃度的鹽溶液中溶解度降低程度的不同而達(dá)到彼此分離的方法。

　�、邴}的選擇：蛋白質(zhì)鹽析常用中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。其中應(yīng)用最廣的是硫酸銨，其優(yōu)點(diǎn)是溫度系數(shù)小而溶解度大（25℃時(shí)飽和溶解度為4.1mol/L,即767g/L;0℃時(shí)飽和溶解度為3.9mol/L，即676g/L)，在這一溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來，而且硫酸銨價(jià)廉易得，分段效果比其他鹽好，不容易引起蛋白質(zhì)變性。應(yīng)用硫酸銨時(shí)，對(duì)蛋白氮的測定有干擾，緩沖能力比較差，故有時(shí)也應(yīng)用硫酸鈉，如鹽析免疫球蛋白，用硫酸鈉的效果也不錯(cuò)，硫酸鈉的缺點(diǎn)是30℃以上溶解度太低。其他的中性鹽如磷酸鈉的鹽析作用比硫酸銨好，但也由于溶解度太低，受溫度影響大，故應(yīng)用不廣。

　　硫酸銨濃溶液的pH在4.5～5.5之間，市售的硫酸銨常含有少量游離硫酸，pH值往往降至4.5以下，當(dāng)用其他pH值進(jìn)行鹽析時(shí)，需用硫酸或氨水調(diào)節(jié)　。

　�、哿蛩徜@飽和度計(jì)算法及加入方式：在分段鹽析時(shí)，加鹽濃度一般以飽和度表示，飽和溶液的飽和度定為100%。用硫酸銨鹽析時(shí)其溶液飽和度調(diào)整方法有3種。一是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液體積不大，所需調(diào)整的濃度不高時(shí)，可加入飽和硫酸銨溶液；飽和硫酸銨配制方法可加入過量的硫酸銨，熱至50～60℃保溫?cái)?shù)分鐘，趁熱濾去沉淀，再在0℃或25℃下平衡1～2天，有固體析出時(shí)即達(dá)100%飽和度。鹽析所需飽和度可按下式計(jì)算：

　　式中V及V0分別代表所需飽和度硫酸銨溶液及原溶液的體積，S2及S1分別代表所需達(dá)到的和原溶液的飽和度。嚴(yán)格來說，混合不同體積的溶液時(shí)，總體積會(huì)發(fā)生變化使上式造成誤差，但這由體積改變所造成的誤差一般小于2%。故可忽略不計(jì)。另一種是所需達(dá)到飽和度較高而溶液的體積又不再過分增大時(shí)，可直接加入固體硫酸銨，其加入量可按下式計(jì)算：

　　式中X是將1升飽和度為S1的溶液提高到飽和度為S2時(shí)所需硫酸銨的重量（g)，G及A為常數(shù)，與溫度有關(guān)。G在0℃時(shí)為707，20℃時(shí)為0.29。為方便起見，在室溫及℃時(shí)所需硫酸銨的飽和度可直接查表2-1、表2-2求出。

表2－1　室溫下由S1提高到S2時(shí)每升加固體硫酸銨的克數(shù)

　�、茺}析時(shí)注意的幾個(gè)問題

　　1)鹽的飽和度：鹽的飽和度是影響蛋白質(zhì)鹽析的重要因素，不同蛋白質(zhì)的鹽析要求鹽的飽和度不同。分離幾個(gè)混合組分的蛋白質(zhì)時(shí)，鹽的飽和度常由稀到濃漸次增加，每出現(xiàn)一種蛋白質(zhì)沉淀進(jìn)行離心或過濾分離后，再繼續(xù)增加鹽的飽和度，使第二種蛋白質(zhì)沉淀。例如用硫酸銨鹽析分離血漿中的蛋白質(zhì)，飽和度達(dá)20%時(shí)，纖維蛋白原首先析出；飽和度增至28%～33%時(shí)，優(yōu)球蛋白析出；飽和度再增至33%～50%時(shí)，擬球蛋白析出；飽和度大于50%以上時(shí)，白蛋白析出。用硫酸銨不同飽和度分段鹽析法，從牛胰中酸性提取分離可得到九種以上蛋白質(zhì)及酶。

　　2)pH值：在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度最小容易沉淀析出，因此，鹽析時(shí)除個(gè)別情況外，pH值常選擇在被分離的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近。

　　3)蛋白質(zhì)濃度：在相同鹽析條件下，蛋白質(zhì)濃度越大越易沉淀，使用鹽的飽和度的極限愈低，如血清球蛋白的溶度從0.5%增到3.0%時(shí)，需用中性鹽的飽和度的最低極限從29%遞減至24%。某一蛋白質(zhì)欲進(jìn)行兩次鹽析時(shí)，第1次由于濃度較稀，鹽析分段范圍較寬，第2次則逐漸收窄，例如用硫酸銨鹽析膽堿酯酶時(shí)，第1次硫酸銨飽和度為35%至60%，第2次為40%至60%。蛋白質(zhì)濃度高些雖然對(duì)沉淀有利，但濃度過高也容易引起其他雜蛋白的共沉作用，因此，必須選擇適當(dāng)濃度，盡可能避免共沉作用的干擾。

表2-2 0℃下由S1提高到S2時(shí)每100ml加固體硫酸銨的克數(shù)

　　4)溫度：由于濃鹽液對(duì)蛋白質(zhì)有一定保護(hù)作用，鹽析操作一般可在室溫下進(jìn)行，至于某些對(duì)熱特別敏感的酶，則宜維持低溫條件。雖然蛋白質(zhì)在鹽析時(shí)對(duì)溫度要求不太嚴(yán)格，但在中性鹽下結(jié)晶純化時(shí)，溫度影響則比較明顯。

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