第五部分 其它免疫學試驗
實驗一 結核菌素試驗
【原理】
結核菌素試驗是最常用的遲發(fā)型超敏反應皮膚試驗，是體內測定機體細胞免疫功能狀態(tài)的方法之一。結核菌素是結核桿菌的菌體成分，注入機體后，如受試者曾經(jīng)受過結核桿菌的感染，則結核菌素與致敏淋巴細胞特異性結合，釋放淋巴因子，在注射局部形成遲發(fā)型超敏反應性炎癥，出現(xiàn)紅腫、硬結。如受試者未受過結核桿菌的感染或未接種過BCG，則無超敏反應發(fā)生。故結核菌素試驗可用來測定機體是否有過結核桿菌的感染或BCG的接種效果，亦可用于檢測機體的細胞免疫功能狀態(tài)。此外用動物檢查結核標本時，在接種前或后也常用此試驗來測定動物對結核桿菌的感染狀況。
【材料】
豚鼠（約250克)、舊結核菌素、注射器、碘酒、酒精、針頭等。
【方法】
1．取白色豚鼠（約250克)，從皮下接種卡介苗1～2次，一個月后取同一豚鼠，剃去腹部一部分毛，用碘酒、酒精消毒后，于皮內注射0.1毫升1∶1000稀釋的結核菌素。
2．注射后72h觀察結果。
【結果】
注射部位有紅腫、硬結，其直徑超過1cm時，即為陽性反應；無任何變化者，則為陰性反應。
【注意事項】
1．本試驗不宜用于結核活動期患者，特別是結核活動期嬰幼兒。
2．常規(guī)試驗陰性者，可分別再用1∶1000、1∶100舊結核菌素作皮試，若仍為陰性者方可判斷為陰性反應。
【思考題】
為什么結核菌素試驗可用于檢測機體的細胞免疫功能狀態(tài)？
實驗二 實驗動物過敏癥
實驗動物過敏癥屬于Ι型超敏反應，與臨床常見的青霉素和異種動物血清引起的過敏性休克相似，通過實驗可進一步加深對Ι型超敏反應機理的理解，提高醫(yī)護人員對人類過敏性休克重要性的認識。
【原理】
先給動物注射異種蛋白，經(jīng)過一定時間后，動物產(chǎn)生的IgE類抗體結合于肥大細胞和嗜堿性粒細胞上，動物處于致敏狀態(tài)。當?shù)诙谓o動物注射較大量相同抗原時，抗原與IgE結合，導致肥大細胞和嗜堿性粒細胞脫顆粒，釋放活性介質，作用于效應器官，產(chǎn)生嚴重的過敏性休克。
【材料】
1．動物 豚鼠（250克左右)。
2．抗原 人血清、雞蛋清。
3．無菌注射器、針頭、碘酒、酒精等。
【方法】
1．取健康豚鼠2只，以 甲、乙編號，分別從甲、乙2 只豚鼠的腹腔或皮下注射1∶10稀釋的人血清0.1毫升，使動物致敏。
2．致敏后14～21d，取甲豚鼠給以心臟注射未稀釋的人血清1～2毫升，乙豚鼠給以心臟注射未稀釋的雞蛋清1～2毫升。
3．注射后，1～5分鐘觀察動物的狀態(tài)。
【結果】
1．注射人血清者經(jīng)幾分鐘后，即出現(xiàn)煩燥不安，抓鼻、聳毛、咳嗽、打噴嚏等現(xiàn)象，繼而發(fā)生呼吸困難、大小便失禁，全身倒向一側，休克死亡。而注射雞蛋清者無任何癥狀出現(xiàn)。
2．豚鼠解剖觀察肺臟的變化，可見甲豚鼠肺臟極度氣腫，而乙豚鼠
肺臟正常。
【注意事項】
1．致敏途經(jīng)除皮下外，還可以釆用腹腔免疫，一般在注射后2～3周，動物即可達到高致敏狀態(tài)，并可維持幾個月。在此期間用相同抗原進行再次注射時，可引起休克反應。
2．作抗原再次注射時，應采用靜脈或心內注射的途徑，使抗原直接進入循環(huán)，才能引起明顯的休克反應，如采用腹腔或皮下注射，只能產(chǎn)生延緩性休克，甚至不發(fā)生休克反應。
【思考題】
結合動物實驗，解釋Ι型超敏反應發(fā)生的機理，并說明為什么乙豚鼠無超敏反應發(fā)生？
實驗三 溶血空斑試驗
【原理】
溶血空斑試驗(Plaque Forming Cell assay， PFC試驗)，是體外檢查和計數(shù)產(chǎn)生IgM(直接法)和其他類型Ig(間接法)的抗體生成細胞的一種方法。具有特異性高、篩檢力強、能直接觀察等優(yōu)點，可作為判斷機體體液免疫功能的指標之一。直接法是取經(jīng)SRBC免疫后第4天的小鼠脾臟，制成脾細胞懸液后，加入SRBC和補體一起混勻于瓊脂糖液中，于37℃溫育后，淋巴細胞釋放溶血素(抗SRBC抗體)，溶血素與周圍的SRBC結合，在補體參與下導致細胞周圍的SRBC溶解，在淋巴細胞周圍形成一個肉眼可見的透明溶血圈(溶血空斑)。間接法是在脾細胞(約免疫l0d后)，SRBC和補體反應系統(tǒng)中再加入高度特異性的抗Ig類血清，例如要檢測IgG抗體生成細胞則要加入抗鼠IgG抗血清，其余操作均同直接法。本試驗僅介紹直接法。
【材料】
1．20%SRBC懸液(用Hanks液配制)。
2．補體 新鮮豚鼠血清(用前經(jīng)靶細胞吸收，l ml壓積SRBC加20ml補體，充分混勻，而后置4℃20min吸收，離心1000rpm，10min，取上清，用Hanks液稀釋為l∶10)。
3．右旋糖酐(DEAE－dextran，分子量50萬，用蒸餾水配制成l0mg／m1，阻止瓊脂的抗補體作用)。
4．瓊脂或瓊脂糖(表層基0.7%，底層基1.4%用Hanks配制)。
5．胎牛血清(56℃30min滅活，并經(jīng)羊紅細胞吸收)。
6．Hanks液。
7．水浴箱調至47～49℃。
8www.med126.com．1ml注射器和青霉素小瓶。
9．玻璃平皿(7×1.5cm)。
10．動物 體重18～25g的純系小鼠。
11．0.5%臺盼藍染液。
12．其他器材 剪刀、鑷子、解剖板、血球計數(shù)板、注射器、紗布、試管等。
【方法】
1．將溶化的底層瓊脂傾注平皿內，成一薄層，待凝固備用。
2．將每管含2ml表層基的試管加熱融化后，放47～49℃水浴保溫。
3．SRBC懸液的制備
以無菌操作抽取綿羊血。保存于阿氏(Alsevers)液內，置4℃保存，一般不超過2周。實驗時取保存的羊血，用生理鹽水洗滌三次，每次離心2000rpm，5min，制成SRBC懸液，計數(shù)，然后按實驗需要配制成20%及2×109／ml的紅細胞懸液。
4．免疫小鼠脾細胞懸液的制備
⑴ SRBC免疫小鼠 最好用純系鼠，體重25g左右，腹腔注射綿羊紅細胞（2×109個／m1)0.5ml或尾靜脈注射0.2ml。測定直接溶血空斑，用免疫后4d的鼠；測定間接溶血空斑，用免疫后10d的鼠。
⑵ 將免疫小鼠拉脫頸椎致死。暴露腹腔，取出脾臟放在周圍有碎冰塊的小瓶內，先用1ml注射器尖端將其搗碎，再加冷Hanks液數(shù)毫升，用注射器抽吸吹打，使細胞分散均勻。經(jīng)尼龍布(或八層紗布)過濾離心去上清，將細胞用冷Hanks液洗滌兩次，再將沉淀的細胞重懸于1ml冷Hanks液內，置冰浴中。
⑶ 脾細胞用白細胞計數(shù)法計數(shù)并用臺盼藍檢查活細胞的百分率。脾細胞制成5～10×107細胞／ml；另取少量脾細胞懸液與等量0.5%臺盼藍混勻，靜置數(shù)分鐘，計數(shù)核被染色死細胞的百分數(shù)，從總細胞數(shù)中將死細胞數(shù)扣除。
5．試驗平皿的制備 將底層平皿和所有試劑(除脾細胞外)預溫40℃左右。于水浴內保溫之表層基中加入以下各試劑：⑴胎牛血清0.1ml；⑵右旋糖酐(10mg／m1)0.1ml(用瓊脂糖時不用此試劑)；⑶20%SRBC懸液0.1ml；⑷脾細胞懸液(5～l0×106細胞／m1)0.1ml。迅速將小試管夾于兩手掌間旋轉混勻，傾注于鋪有底層之平皿內，避免傾入氣泡。在水平臺上使表層基鋪平，凝固后，放37℃孵育1h。然后于每個平皿內加1∶l0稀釋的補體1.5～2ml，使均勻覆蓋其表面，再次孵育30min，即可用肉眼或放大鏡觀察溶血空斑，并計數(shù)。
【結果】
將平皿劃分小格，用放大鏡觀察并計數(shù)溶血空斑總數(shù)，再換算出每百萬脾細胞中所含抗體形成細胞數(shù)。如用于藥物篩選，可比較給藥組和對照組每百萬脾細胞(1×106)中抗體形成細胞數(shù)的平均值，以表示藥物的刺激作用或抑制作用。
【注意事項】
1．綿羊紅細胞最好用新鮮脫纖維的SRBC。洗滌SRBC時，離心速度以2000rpm，10min為宜，不超過三次。用前鏡檢如有變形，表示脆性增大，不宜采用。
2．SRBC可大致計數(shù)，但脾細胞計數(shù)必須準確。
3．免疫動物必須用純系動物，雜種動物個體差異大，難以比較。最好先作幾次預試驗，使每個平皿空斑數(shù)控制在100～150個左右為宜。
4．補體濃度以l∶10為宜，無需經(jīng)過滴定。但若用瓊脂鋪板時則補體原液不必稀釋，以阻止瓊脂的抗補體作用。
5．所有器皿和各種試劑在加入表層基前均需預溫，并在水平臺上操作。
6．離體的脾細胞應不離冰浴，防止細胞死亡。
【思考題】
1．簡述溶血空斑試驗的原理及其實際應用。
2．在本試驗中，綿羊紅細胞有什么作用？
實驗四 生物制品
用于人工免疫的抗原、免疫血清、免疫細胞和免疫分子制劑，以及診斷用的生物制劑統(tǒng)稱為生物制品(biologic product)。生物制品主要分為三類，即預防接種制品、治療制品和診斷用品。
一、預防接種制品
國內常將由細菌、螺旋體制備的用于人工自動免疫的生物制品稱為菌苗，而將由病毒、立克次體等制備的用于人工自動免疫的生物制品稱為疫苗。國際上常將其統(tǒng)稱為疫苗。
(一) 菌苗類
1．死菌苗 霍亂菌苗、傷寒菌苗，傷寒、副傷寒甲、乙三聯(lián)菌苗，霍亂、傷寒、副傷寒甲、乙四聯(lián)菌苗，百日咳菌苗等。
2．活菌苗 卡介苗(BCG)、鼠疫活菌苗。
（二)疫苗類
1．死疫苗 流行性乙型腦炎鼠腦疫苗、雞胚疫苗、組織培養(yǎng)疫苗、斑疹傷寒鼠肺疫苗。
2．活疫苗 脊髓灰質炎減毒活疫苗。
3．類毒素類
由細菌外毒素制備的人工自動免疫制品稱為類毒素，如白喉類毒素、精制磷酸鋁吸附白喉類毒素、破傷風類毒素、精制磷酸鋁吸附破傷風類毒素等。
4．混合制品類
百日咳菌苗和白喉類毒素混合制品，百日咳菌苗、白喉、破傷風類毒素混合制品。
二、治療制品
（一)抗毒素
用類毒素免疫動物獲得的人工被動免疫制品稱為抗毒素。如精制白喉抗毒素、精制破傷風抗毒素、干燥粉劑破傷風抗毒素。
（二)其它免疫血清制品
胎盤球蛋白、丙種球蛋白、抗麻疹人血清、抗淋巴細胞血清(anti-lymphocyteserum， ALS)、 抗淋巴細胞丙種球蛋白(anti-lymphocyte γ globulin， ALG)等。
（三)免疫細胞和免疫分子制劑
轉移因子（transfer factor，TF)、免疫核糖核酸(immune RNA，iRNA)、胸腺素(thymosin)等。
三、診斷用品
（一)舊結核菌素(old tuberculin，OT)和精制結核蛋白衍生物(purified protein der中國衛(wèi)生人才網(wǎng)ivative，PPD)。
（二)錫克氏毒素（Schick’s toxin)、狄克氏毒素(Dick’s toxin)。
（三)診斷菌液 變形桿菌OX19、OXK 等菌液。
（四)診斷血清 沙門氏菌屬因子血清，志賀氏菌屬因子血清，甲胎蛋白診斷血清，羊抗人IgG、IgA、IgM診斷血清等。
【思考題】
1．常用于預防接種和免疫治療的生物制品有哪些？其應用原理與原則如何？
2．什么是人工主動免疫和人工被動免疫？
