第四部分 非特異性免疫試驗(yàn)
機(jī)體抵抗病原微生物感染的免疫機(jī)制主要包括非特異性免疫與特異性免疫，其中非特異性免疫(亦稱(chēng)www.med126.com固有免疫)是機(jī)體對(duì)抗病原微生物感染的第一道防線，包括：皮膚的機(jī)械阻擋作用；黏膜可分泌許多液體，如淚液、唾液、腸液等，其中含有溶菌酶可溶解和殺死細(xì)菌；正常血清中含有許多抗菌物質(zhì)，如補(bǔ)體系統(tǒng)、乙型溶素等，可殺死革蘭氏陰性或陽(yáng)性菌；血液中的中性粒細(xì)胞和組織中的巨噬細(xì)胞對(duì)外來(lái)異物有吞噬和消化作用。非特異性免疫生來(lái)即有，作用廣泛，無(wú)專(zhuān)一性，不僅產(chǎn)生非特異抗感染免疫作用，而且在特異性免疫應(yīng)答過(guò)程中也起重要作用。
實(shí)驗(yàn)一 溶菌酶的溶菌作用
【原理】
溶菌酶主要是由吞噬細(xì)胞合成并分泌的一種分子量約為14.7kDa的堿性蛋白質(zhì)，屬乙酰氨基多糖酶，不耐熱。由于它的高等電點(diǎn)(pH11.0)，能與細(xì)菌牢固結(jié)合，從而水解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖，使細(xì)菌死亡或裂解，主要作用于革蘭陽(yáng)性細(xì)菌，溶菌酶還有激活補(bǔ)體和促吞噬作用。
溶菌酶廣泛存在于機(jī)體的淚液、唾液、痰、鼻腔分泌物及血清等體液中，檢測(cè)體液溶菌酶水平在一定程度上反映單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的功能狀態(tài)。
溶菌酶的溶菌活性可通過(guò)對(duì)革蘭陽(yáng)性微球菌(MicrococusLysodeikticus)的裂解作用進(jìn)行測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)介紹紙片法進(jìn)行唾液溶菌酶溶菌活性的測(cè)定。
【材料】
1．無(wú)菌pH6.4、1/15mol／L PBS，5N KOH溶液，溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品。
2．微球菌普通瓊脂斜面26～36h培養(yǎng)物。
3．受檢者唾液。
4．3%瓊脂(用pH6.4、1／15mol／L PBS配制)。
5．lml、5ml無(wú)菌吸管，無(wú)菌毛細(xì)吸管、平皿、無(wú)菌濾紙片(直徑4mm)、塑料小杯、小鑷子等。
【方法】
1．含微球菌瓊脂平板的制備 取無(wú)菌溶化的3%瓊脂10ml，待冷至60～70℃時(shí)加入5ml預(yù)熱的微球菌菌液，迅速混勻，傾注于無(wú)菌平皿內(nèi)，平放待凝。
2．收集唾液標(biāo)本置于塑料小杯內(nèi)。
3．溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品的配制 稱(chēng)取溶菌酶干粉5mg，使其溶解于0.15mol／L pH6.4磷酸鹽緩沖液5ml內(nèi)，即獲1000ug／ml溶菌酶溶液。然后將其作1∶5、1∶10、1∶20、1∶40和1∶80倍比稀釋?zhuān)蔀槊亢辽?00ug、100ug、50ug、25ug和12.5ug的標(biāo)準(zhǔn)溶菌酶液。
4．取濾紙片分別于標(biāo)準(zhǔn)溶菌酶液，待檢標(biāo)本(唾液)和生理鹽水(陰性對(duì)照)中浸透。
5．用記號(hào)筆在含微球菌的瓊脂平板底面先做好標(biāo)記，再用小鑷子分別夾取含不同濃度溶菌酶的濾紙片及含待測(cè)標(biāo)本或?qū)φ盏募埰�，小心平貼于瓊脂表面。
6．置平板于37℃溫箱18～24h后觀察結(jié)果。
【結(jié)果】
觀察濾紙片周?chē)欠癯霈F(xiàn)透明的溶菌環(huán)。如有，用游標(biāo)尺測(cè)量溶菌環(huán)直徑。以標(biāo)準(zhǔn)品溶菌酶的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)濃度溶菌環(huán)直徑的均值為縱坐標(biāo)，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。并根據(jù)檢測(cè)樣品的溶菌環(huán)直徑，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出其相應(yīng)溶菌酶濃度，乘以樣品的稀釋倍數(shù)，則可對(duì)標(biāo)本中所含溶菌酶做定量測(cè)定。
【注意事項(xiàng)】
1．濾紙片應(yīng)浸有足夠的標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，但它們不能成滴溢出。
2．最好在每個(gè)瓊脂平板上都放有不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品濾紙片，可以盡量減少平板間的結(jié)果誤差。
【思考題】
1．溶菌酶的溶菌作用有何生物學(xué)意義?
2．為什么要對(duì)溶菌酶進(jìn)行定量測(cè)定?
實(shí)驗(yàn)二 補(bǔ)體參與的試驗(yàn)
補(bǔ)體是存在于人和脊椎動(dòng)物血清與組織液中一組經(jīng)活化后具有酶活性的蛋白質(zhì)，廣泛參與機(jī)體抗微生物防御反應(yīng)以及免疫調(diào)節(jié)，也可介導(dǎo)免疫病理的損傷性反應(yīng)，是體內(nèi)具有重要生物學(xué)作用的效應(yīng)系統(tǒng)和效應(yīng)放大系統(tǒng)。
一、溶血素效價(jià)的測(cè)定
【原理】
小鼠或家兔等動(dòng)物經(jīng)綿羊紅細(xì)胞(SRBC)免疫后血清中可出現(xiàn)抗SRBC的抗體。采集免疫動(dòng)物血液分離血清，即可獲得抗SRBC的抗血清。用SRBC與相應(yīng)抗血清混合時(shí)，當(dāng)有補(bǔ)體存在時(shí)，在一定條件下，SRBC被破壞溶解，故抗SRBC抗體又稱(chēng)為溶血素。使一定量SRBC完全溶解的溶血素最高血清稀釋度稱(chēng)溶血素的效價(jià)。
【材料】
1．抗體 含溶血素血清(用生理鹽水1∶100稀釋)。
2．抗原 2%SRBC懸液。
3．補(bǔ)體 取自豚鼠新鮮血清，生理鹽水1∶30稀釋。
4．其他 37℃水浴箱、試管、吸管、生理鹽水等。
【方法】
按表4—1加入各試驗(yàn)材料。
表4-1 溶 血 素 單 位 滴定單位：ml
試管號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 8 9
生理鹽水 0.9 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
含溶血素 ↘ ⌒↘ ⌒↘ ⌒↘ ⌒↘ ⌒↘ ⌒↘ ⌒↗棄0.5
(1∶100)血清 0.1 → 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
血清稀釋度 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 衛(wèi)生資格考試網(wǎng)1/16000 1/32000 1/64000 1/128000
補(bǔ)體(1∶30) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
2%SRBC 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
搖勻后置于37℃水浴箱中30min
結(jié) 果
【結(jié)果】
將各管發(fā)生溶血的情況記錄于上表“結(jié)果”一項(xiàng)。以“完全溶血”“不完全溶血”“完全不溶血”三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判斷。完全溶血指試管中綿羊紅細(xì)胞全部被破壞，試管中的溶液呈均勻紅色，清亮透明，試管底無(wú)紅細(xì)胞沉積。不完全溶血指綿羊紅細(xì)胞部分被破壞，試管中的溶液呈紅色半渾濁，可見(jiàn)部分紅細(xì)胞沉于管底。完全不溶需是指沒(méi)有綿羊紅細(xì)胞破壞，試管中的溶液呈紅色渾濁，可見(jiàn)部分紅細(xì)胞沉于管底。第9管(對(duì)照管)必需是“完全不溶血”時(shí)前面各管的結(jié)果才有意義。使一定量SRBC完全溶解的溶血素最高血清稀釋度即為溶血素的效價(jià)，若溶血素效價(jià)為1∶8000，則8000倍稀釋的溶血素為1單位。做補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)時(shí)常用0.2ml中含2個(gè)溶血素單位的稀釋液，可取1∶100的溶血素lml加生理鹽水39ml即得。
【注意事項(xiàng)】
1．補(bǔ)體的血清必須新鮮。
2．SRBC用前一定要搖勻。
【思考題】
溶血素破壞紅細(xì)胞為什么必須有補(bǔ)體參加？不加補(bǔ)體會(huì)出現(xiàn)什么結(jié)果？
二、總補(bǔ)體溶血活性測(cè)定(CH50測(cè)定)
【原理】
CH50測(cè)定(total hemolytic complement assay，CH50 assay)是利用補(bǔ)體能使溶血素致敏的綿羊紅細(xì)胞(致敏的綿羊紅細(xì)胞即綿羊紅細(xì)胞與相應(yīng)抗體形成的免疫復(fù)合物)發(fā)生溶血，當(dāng)致敏紅細(xì)胞濃度恒定時(shí)，在一定范圍內(nèi)溶血程度與補(bǔ)體的量及活性呈正比例關(guān)系。因此，以溶血程度為縱坐標(biāo)，補(bǔ)體量為橫坐標(biāo)繪圖，可得“S”型曲線（如圖4-1)，曲線兩端平坦，補(bǔ)體量的增減與溶血程度影響不大，而在曲線中段（50%溶血附近)曲線最陡，幾乎成一垂直線，此時(shí)補(bǔ)體量的細(xì)微變化可引起溶血程度的明顯改變，故取50%溶血為終點(diǎn)觀察指標(biāo)，即以引起50%溶血的最小血清量作為一個(gè)CH50單位。臨床上，CH50測(cè)定可用于某些超敏反應(yīng)性疾病的輔助診斷，也可作為觀察病情變化的指標(biāo)。
圖4-1 CH50測(cè)定
【材料】
1．緩沖鹽水(pH7.4)
⑴ 10×貯備液 NaCl 75g、lmol／L HCl 177ml、三乙醇胺28ml、MgCl2•6H2O 1.0g、CaCl2•2H2O 0.2g。先將NaCl溶于700ml蒸餾水中，加入HCl及三乙醇胺，MgCl2及CaCl2分別用2ml蒸餾水溶解后，逐一緩慢加入，再用蒸餾水加至1000ml。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
⑵ 應(yīng)用液 取1份貯備液，加9份蒸餾水，4℃保存待用。
2．2%SRBC懸液 新鮮脫纖維羊血或Alsever液保存羊血(4℃可保存3周)，生理鹽水洗2次，第3次用緩沖鹽水，離心2000rpm，10min。壓積細(xì)胞用緩沖鹽水配成2%懸液。為使紅細(xì)胞濃度標(biāo)準(zhǔn)化，可將2%細(xì)胞懸液用緩沖鹽水稀釋25倍，于分光光度計(jì)(542nm)測(cè)定其透光率(以緩沖鹽水校正透光率至100%)，每次試驗(yàn)用紅細(xì)胞濃度(透光率)必須一致。
3．溶血素按效價(jià)以緩沖鹽水稀釋至2單位 (如效價(jià)為1∶8000，使用時(shí)按1∶4000稀釋) 。
4．致敏SRBC 2%SRBC加等量2單位溶血素，混勻置37℃水浴10min。
5．待檢血清。
6．試管、吸管、離心機(jī)、37℃水浴箱、分光光度計(jì)等。
【方法】
1．取待檢血清0.2ml，加緩沖鹽水3.8ml，使成1∶20稀釋液。
2．取干凈試管10支，按表4—2所示加入各試劑，混勻，試管置37℃水浴30min。
3．50%溶血標(biāo)準(zhǔn)管 于2ml 2%SRBC懸液中加入8ml蒸餾水，混勻，使完全溶血，然后取此液體2ml加pH7.4緩沖鹽水2ml，混勻后即為50%溶血管。
表4-2 CH50測(cè)定 單位：ml
管號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1∶20稀釋血清 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 -
緩沖鹽水(pH7.4) 1.40 1.35 1.30 1.25 1.20 1.15 1.10 1.05 1.00 1.50
2U溶血素 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
2%SRBC 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
總補(bǔ)體CH50(U/ml) 200 133 100 80 66.5 57.1 50 44.4 40 -
【結(jié)果】
將各試驗(yàn)管經(jīng)2500rpm，5min，用肉眼找出最接近50%溶血管的試驗(yàn)管后，用分光光度計(jì)(542nm，0.5cm比色杯)讀該管的A542值，即可求出補(bǔ)體總?cè)苎钚�。此�?shù)值即用以表示血清的總補(bǔ)體活性。
計(jì)算：
1
血清總補(bǔ)體CH50(U/ml)= × 稀釋倍數(shù)
引起50%溶血管血清量(ml)
假設(shè)第4管的光密度最接近標(biāo)準(zhǔn)管，則補(bǔ)體含量為1/0.25×20=80U/ml，表4-2中提供各管相應(yīng)補(bǔ)體含量，可不必計(jì)算而能直接查出，第10管為空白對(duì)照管，要求不溶血。
正常參考值：50～100U／ml。
【注意事項(xiàng)】
1．緩沖液、致敏羊紅細(xì)胞均應(yīng)新鮮配制。
2．實(shí)驗(yàn)器材應(yīng)清潔。
3．待測(cè)標(biāo)本必須新鮮，應(yīng)無(wú)溶血、無(wú)污染、無(wú)乳糜血。如放置2h會(huì)使補(bǔ)體活性下降。
4．補(bǔ)體的溶血活性受多種因素的影響，如綿羊紅細(xì)胞濃度及致敏抗體的量等。鈣、鎂離子的存在可穩(wěn)定溶血系統(tǒng)，但含量過(guò)多時(shí)，反而抑制溶血反應(yīng)。
【思考題】
1．何為CH50單位？為何取50%溶血為終點(diǎn)觀察指標(biāo)？
2．血清標(biāo)本放置時(shí)間長(zhǎng)后補(bǔ)體活性會(huì)有何變化？
實(shí)驗(yàn)三 吞噬細(xì)胞吞噬作用及吞噬殺菌功能測(cè)定
病原微生物一旦突破體表防御屏障侵入機(jī)體，首先接觸遍布全身的大、小吞噬細(xì)胞，它們分布于血液和組織中，并可在某些趨化因子的作用下被吸引至微生物侵入部位。吞噬細(xì)胞依據(jù)其形態(tài)大小分為兩大類(lèi)：一類(lèi)是血液中的單核細(xì)胞及由血液游走到血管外并固定于各組織中的巨噬細(xì)胞，稱(chēng)為大吞噬細(xì)胞；另一類(lèi)是血液中的嗜中性粒細(xì)胞稱(chēng)為小吞噬細(xì)胞。它們是機(jī)體非特異性免疫的重要因素。
一、巨噬細(xì)胞的吞噬作用——大吞噬現(xiàn)象(體外法)
【材料】
1．體重25g左右的小鼠。
2．5ml、lml無(wú)菌注射器，6號(hào)、9號(hào)針頭，10ml離心管，清潔載玻片，燒杯，解剖剪，眼科鑷，濕盒，解剖板，圖釘，37℃水浴箱。
3．4%淀粉肉湯 稱(chēng)面粉3克、可溶性淀粉5克、加營(yíng)養(yǎng)肉湯至100ml，混勻，先微火加熱，不斷攪拌使成糊狀。再高壓滅菌。臨用時(shí)，與無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯等量混合。
4．D-Hanks液(配方見(jiàn)附錄)。
5．生理鹽水。
6．2%雞紅細(xì)胞 無(wú)菌操作抽取雞翅靜脈血，抗凝，置于離心管中，用無(wú)菌生理鹽水洗3次，最后一次離心2000rpm，10min，按壓積將雞紅細(xì)胞用Hanks液配成2%濃度。
7．瑞特氏染色液。
8．pH6.4～6.8磷酸鹽緩沖液 20ml 1%Na2HP04，30ml 1%KH2P04，加蒸餾水至1000ml，混勻。
【方法】
1．實(shí)驗(yàn)前三天給小鼠腹腔內(nèi)注射lml 4%淀粉肉湯。
2．實(shí)驗(yàn)當(dāng)天給小鼠腹腔內(nèi)注射Hanks液3～4ml，輕揉腹部，讓小鼠活動(dòng)10min。
3．眼球放血后頸椎脫臼處死小鼠，并將小鼠釘在解剖板上。
4．碘酒、酒精消毒腹部皮膚，左手持鑷提起腹中部，用解剖剪在皮膚上剪5mm長(zhǎng)的小口，將皮膚朝頭尾部方向剝開(kāi)，暴露腹壁。
5．用鑷子提起腹壁，避開(kāi)血管剪一小口，用5ml注射器(帶9號(hào)針頭)或毛細(xì)吸管吸取腹腔液滴于載片上，每片2～3滴，并滴加等量的2%雞紅細(xì)胞懸液，充分混勻。
6．將玻片置于濕盒內(nèi)，放37℃水浴箱內(nèi)35～45min，期間輕晃動(dòng)玻片二次。
7．取出后，將載玻片在生理鹽水中漂洗2次，洗去未吸附在玻片上的細(xì)胞。待其自然干燥。
8．用瑞特氏染色液染色
⑴ 于玻片上滴加瑞特氏染色液數(shù)滴覆蓋涂片，染色l min。
⑵ 滴加相當(dāng)于染色液1.5倍量的pH6.8磷酸鹽緩沖液(可用蒸餾水代替)于涂片上，輕搖玻片，混勻染色液，染8～10min。
⑶ 流水沖洗，印干后用油鏡觀察結(jié)果。
【結(jié)果】
因巨噬細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，能粘附在清潔載玻片上，故經(jīng)瑞特氏染色后，鏡下可見(jiàn)巨噬細(xì)胞呈橢圓形、腎形或馬蹄形，其核較大，染色質(zhì)比較疏松，染成淡紫藍(lán)色，胞漿染成淺灰藍(lán)色，如有吞噬作用發(fā)生，可見(jiàn)巨噬細(xì)胞胞漿中有一個(gè)以上的有核雞紅細(xì)胞。如果吞噬的雞紅細(xì)胞較多，則巨噬細(xì)胞核被擠到一側(cè)，其形態(tài)不典型。隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)巨噬細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)吞噬有雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)和被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)。
吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)
吞噬百分率= ×100%
100個(gè)巨噬細(xì)胞
100個(gè)吞噬細(xì)胞中所吞噬的雞紅細(xì)胞數(shù)
吞噬指數(shù)= ×100%
100個(gè)巨噬細(xì)胞
此外，在計(jì)數(shù)時(shí)，應(yīng)同時(shí)注意雞RBC被消化的程度，分為4級(jí)：
I級(jí) 未消化—胞漿淺紅色或淺黃綠色、胞核淺紫紅色。
Ⅱ級(jí) 輕度消化—胞漿淺黃綠色；胞核固縮，染成紫藍(lán)色。
Ⅲ級(jí) 重度消化—胞漿淡染，胞核成淺灰黃色。
Ⅳ級(jí) 完全消化—巨噬細(xì)胞內(nèi)只見(jiàn)形狀似紅細(xì)胞大小的空泡，邊緣整齊，胞核隱約可見(jiàn)。
吞噬百分率和吞噬指數(shù)增高，表明機(jī)體大吞噬細(xì)胞的吞噬能力強(qiáng)，反之則吞噬能力弱。
【注意事項(xiàng)】
1．所用器材要干凈。
2．越接近涂片末稍細(xì)胞數(shù)越多，故計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)取片子的前、中、后三段計(jì)數(shù)，以提高準(zhǔn)確性。
3．凡需要瑞特氏染色的涂片必須在空氣中自然干燥后再染色，避免加熱干燥。否則細(xì)胞因受熱脫水而皺縮，影響吞噬現(xiàn)象的觀察。
二、中性粒細(xì)胞的吞噬作用——小吞噬現(xiàn)象
（一)體內(nèi)法
【材料】
1．白色葡萄球菌菌液，將白色葡萄球菌接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，培養(yǎng)18～24h，用無(wú)菌生理鹽水洗下培養(yǎng)物，經(jīng)Mafaland比濁法配成3×108個(gè)細(xì)菌／ml的懸液備用。
2．清潔載玻片、無(wú)菌注射器(1m1)及6號(hào)、9號(hào)針頭。
3．無(wú)菌肉湯。
4．小鼠(雌雄隨機(jī))體重25克左右。
5．瑞氏染色液(配制見(jiàn)附錄)，pH6.8磷酸鹽緩沖液(或蒸餾水)。
【方法】
1．于實(shí)驗(yàn)前1h給小鼠腹腔內(nèi)注射lml肉湯，誘導(dǎo)漿液滲出。
2．用帶6號(hào)針頭的注射器向小鼠腹腔內(nèi)注射白色葡萄球菌菌液lml，讓小鼠活動(dòng)。
3．分別在注射菌液30～45min后按前述方法處死并剖開(kāi)小鼠并用帶9號(hào)針頭的注射器或毛細(xì)吸管抽取腹腔液涂片，自然干燥。
4．瑞特氏染色后，油鏡觀察。
【結(jié)果】
中性粒細(xì)胞的細(xì)胞核染成深紫紅色，核分2～5葉，細(xì)胞漿染成淡粉紅色，白色葡萄球菌染成深紫色。隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)中性粒細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)吞噬有細(xì)菌的吞噬細(xì)胞數(shù)和所吞噬的細(xì)菌總數(shù)，按上述公式分別計(jì)算出吞噬百分率和吞噬指數(shù)。
【注意事項(xiàng)】
同大吞噬現(xiàn)象。
（二)體外法
【材料】
1．3.8%枸櫞酸鈉。
2．葡萄球菌菌液。
3．清潔載玻片、無(wú)菌注射器(1m1)、6號(hào)、9號(hào)針頭及無(wú)菌肉湯。
4．瑞氏染色液，pH6.8磷酸鹽緩沖液(或蒸餾水)。
【方法】
1．自靜脈采血0.2ml，置于含3.8%枸櫞酸鈉0.2ml的小試管中，混勻，防止凝血(可抽一個(gè)人血５ml抗凝，供全小班使用)。
2．取葡萄球菌菌液0.1ml，加入上述血液中，混勻。
3．37℃靜置孵育30min，期間于15或20min時(shí)震蕩一次。
4．取出試管，用毛細(xì)管吸取白細(xì)胞層(即沉淀紅細(xì)胞的表層)，制成血膜，自然干燥。
5．瑞特氏染色后，油鏡觀察。
【結(jié)果】
同體內(nèi)法。
【注意事項(xiàng)】
同大吞噬現(xiàn)象。
三、中性粒細(xì)胞的殺菌功能測(cè)定
——硝基藍(lán)四氮唑(NBT)還原試驗(yàn)
【原理】
中性粒細(xì)胞在殺菌過(guò)程中能量消耗聚增，耗氧量增加，葡萄糖已糖磷酸旁路代謝的活力增強(qiáng)，此時(shí)如加入硝基藍(lán)四氮唑(nitrobluetetra-Zolium，NBT)，葡萄糖分解的中間產(chǎn)物6-磷酸葡萄糖氧化所脫的氫可被NBT接受，NBT被還原，從淡黃色變成藍(lán)黑色，以點(diǎn)狀或斑塊狀顆粒沉積于胞漿中，這種細(xì)胞稱(chēng)為NBT陽(yáng)性細(xì)胞。鏡下檢查NBT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量便可推知中性粒細(xì)胞的功能，臨床上也可作慢性肉芽腫等吞噬細(xì)胞功能缺陷病的輔助診斷指標(biāo)。
【材料】
1．清潔小試管(12×100mm)，載玻片，毛細(xì)吸管。
2．肝素抗凝的人外周血。
3．生理鹽水。
4．NBT試劑 0.28%NBT生理鹽水溶液0.6ml、牛血清0.5ml、生理鹽水、0.3ml的混合液。
5．瑞特氏染色液。
6．37℃水浴箱等。
【方法】
1．滴加一滴肝素抗凝的人血標(biāo)本于清潔載玻片上，濕盒內(nèi)放置10min，在此期間中性粒細(xì)胞可粘附在載玻片上。
2．用生理鹽水輕輕沖洗玻片，沖去未粘附的細(xì)胞，并用吸水紙吸去多余的水分。
3．標(biāo)本上加1滴NBT試劑，放濕盒內(nèi)于37℃水浴反應(yīng)20min。取出載玻片，自然干燥。
4．瑞特氏染色，油鏡鏡檢。
【結(jié)果】
中性粒細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)點(diǎn)狀或塊狀藍(lán)黑色沉淀物的為NBT陽(yáng)性細(xì)胞。計(jì)數(shù)100個(gè)中性粒細(xì)胞，求出NBT陽(yáng)性細(xì)胞百分率。百分率愈高，表明中性粒細(xì)胞的吞噬功能越強(qiáng)。陽(yáng)性細(xì)胞百分率可作為區(qū)別細(xì)菌性與病毒性感染的指標(biāo)之一，當(dāng)機(jī)體受細(xì)菌感染時(shí)，NBT陽(yáng)性細(xì)胞增多，受病毒感染時(shí)，NBT反應(yīng)一般正常。
【注意事項(xiàng)】
1．在吞噬試驗(yàn)過(guò)程中玻片不能干，否則吞噬作用將不能進(jìn)行。
2．在染色前，玻片上的標(biāo)本一定要自然干燥，不宜加熱烘干，否則細(xì)胞會(huì)固縮而影響細(xì)胞形態(tài)。
3．瑞特氏染色時(shí)染液與磷酸鹽緩沖液的比例一定要合適。
4．NBT染液用前要過(guò)濾，不要?dú)埩纛w粒。
5．所用玻片必須干凈，以避免玻璃表面雜質(zhì)參與NBT的還原作用。
【思考題】
1．為什么說(shuō)吞噬細(xì)胞是機(jī)體抗感染的重要防線?如果吞噬功能喪失，對(duì)機(jī)體會(huì)有什么影響?
2．吞噬百分率與吞噬指數(shù)有何異同？
3．小吞噬實(shí)驗(yàn)與NBT還原試驗(yàn)意義上有什么區(qū)別？
4．為何NBT還原試驗(yàn)可以區(qū)別受試者是受細(xì)菌感染還是受病毒感染?
