衛(wèi)生毒理學電子教材-第八章 外來化合物的生殖發(fā)育毒性及其評價:第三節(jié) 發(fā)育毒性及其評定

（一)發(fā)育毒性

某些外來化合物可干擾胚胎以及胎兒的發(fā)育過程，影響正常發(fā)育。具體表現(xiàn)可分為：

1．生長遲緩。即胚胎與胎仔的發(fā)育過程在外來化合物影響下，較正常的發(fā)育過程緩慢。

2．致畸作用。由于外來化合物干擾，活產(chǎn)胎仔胎兒出生時，某種器官表現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)異常。致畸作用所表現(xiàn)的形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，在出生后立即可被發(fā)現(xiàn)。

  3．功能不全或異常。即胎仔的生化、生理、代謝、免疫、神經(jīng)活動及行為的缺陷或異常。功能不全或異常往往在出生后一定時間才被發(fā)現(xiàn)，因為正常情況下，有些功能在出生后一定時間才發(fā)育完全。

 4．胚胎或胎仔致死作用。某些外來化合物在一定劑量范圍內(nèi)，可在胚胎或胎仔發(fā)育期間對胚胎或胎仔具有損害作用，并使其死亡。具體表現(xiàn)為天然流產(chǎn)或死產(chǎn)、死胎率增加。在一般情況下，引起胚胎或胎仔死亡的劑量較致畸作用的劑量為高，而造成發(fā)育遲緩的劑量往往低于胚胎毒性作用劑量，但高于致畸作用的劑量。

致畸作用是外來化合物發(fā)育毒性的一種具體表現(xiàn)，對存活后代機體影響較為嚴重，往往是一種不可逆過程。有些文獻中將致畸作用稱為發(fā)育毒性，可以理解為發(fā)育毒性的俠義概念。

   （二)畸形、畸胎和致畸物

  器官形態(tài)的異常稱為畸形。

  具有畸形的胚胎或胎仔，稱為畸胎。

  凡在一定劑量下，能通過母體對胚胎或胎兒正常發(fā)育過程造成干擾，使子代出生后具有畸形的化合物稱為致畸物或致畸原。

     （三)胚胎毒性作用

    外來化合物引起的胎仔生長發(fā)育遲緩和功能缺陷不全的損害作用。其中不包括致畸和胚胎致死作用。

   （四)母體毒性作用

  母體毒性作用是指外來化合物在一定劑量下，對受孕母體產(chǎn)生的損害作用。具體表現(xiàn)包括體重減輕、出現(xiàn)某些臨床癥伏、直至死亡。母體毒性作用可分為輕度和嚴重母體中毒。輕度母體中毒的表現(xiàn)應限于母體體重下降，正常增長受到抑制。抑制程度，不超過不接觸受試物對照組動物的10%。肝重可略有增加，但生殖機能正常；嚴重母體中毒可出現(xiàn)體重增長大幅度抑制、持久性嘔吐、過度安靜或活動過度、呼吸困難、生育機能明顯受損及其它中毒癥狀，甚至死亡。

   （五)母體毒性作用與致畸作用關(guān)系

外來化合物的母體毒性作用與致畸作用的關(guān)系有下列幾種：

1. 具有致畸作用，但無母體毒性出現(xiàn)。表明此種外來化合物的致畸作用具有特定的作用機理，與母體毒性無關(guān)。此種受試物致畸作用往往較強，應特別注意。

2．出現(xiàn)致畸作用的同時也表現(xiàn)母體毒性。此種受試物可能既對胚胎有特定的致畸機理，同時也對母體具有損害作用，但二者并無直接聯(lián)系。

3．不具有特定致畸作用機理，但可破壞母體正常生理穩(wěn)態(tài)，以致對胚胎具有非特異性的影響，并造成畸形。

4．僅具有母體毒性，但不具有致畸作用。

5．在一定劑量下，既不呈現(xiàn)母體毒性，也未見致畸作用。此種情況并不能確定受試物確實不具致畸作用。可能是動物接觸的劑量未達到致畸作用的最小有作用劑量，即致畸閾劑量，并非真正不具有致畸作用。在對一種外來化合物進行致畸試驗時，如未觀察到致畸作用，也無母體毒性表現(xiàn)，應在動物可能耐受條件下，最大限度地增加劑量，使其遠遠高于人類實際可能接觸的水平，如仍未出現(xiàn)致畸作用，才可做出結(jié)論。

（一)器官發(fā)生期的胚胎對致畸物最為敏感

具有發(fā)育毒性的外來化合物與發(fā)育中的胚胎或胎仔接觸，可因胚胎或胎仔所處的發(fā)育階段不同而呈現(xiàn)不同的敏感性。有性生殖動物由受精卵發(fā)育成為成熟個體的過程，可概括為胚泡形成、著床、器官發(fā)生、胎兒發(fā)育以及新生兒發(fā)育等階段。著床前的胚胎對胚胎致死作用較為易感，對致畸作用并不如此。在胚胎發(fā)育后期和新生兒期，最容易表現(xiàn)的發(fā)育毒性是生長遲緩和神經(jīng)、內(nèi)分泌以及免疫系統(tǒng)機能的改變。胎仔或胎兒對胚胎致死作用的易感性雖較胚胎為低，但仍有一定數(shù)目的死產(chǎn)胎發(fā)生。

在致畸作用中，對致畸物最敏感的階段是器官發(fā)生期，一般稱為危險期或關(guān)鍵期。在常用試驗動物中，自受精日計算，大鼠器官發(fā)生期約為9～17天，小鼠器官發(fā)生期為7.5～16天，家兔為11～20天。在器官發(fā)生期中，致畸物與胚胎接觸可能造成形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，但如在著床前胚泡形成階段接觸致畸物，則往往出現(xiàn)胚胎死亡，畸形極少。大鼠著床前胚泡形成期，自受精日計算，約為3～4天，開始著床日約為5.5～6天；小鼠分別為3～4天和4.5～5天；家兔分別為3～4天和7天。

同一劑量的一種致畸物在敏感期中與胚胎接觸，可因胚胎所處發(fā)育階段不同而出現(xiàn)不同的畸形。例如，以20mg/kg體重劑量環(huán)磷酰胺在受精后第8～12天期間，每日分別給予小鼠，雖然畸形多出醫(yī)學三基現(xiàn)于前肢趾部，但畸形種類，則可因給予的日期不同而分別為多趾，并趾，缺趾和無趾。如將大量維生素A在受精后第8天給予大鼠，主要出現(xiàn)骨骼畸形；如在第12天給予，則誘發(fā)腭裂。同樣劑量砷酸鈉在小鼠受精第7天和第9天分別給予，前者主要出現(xiàn)臍疝，后者主要為露腦。

發(fā)育中的胚胎對致畸作用的敏感期雖然主要在器官發(fā)生期，但在此期間，各種不同器官還各有特別敏感的時間。大鼠器官發(fā)生期為受精后9～17天，但眼的最敏感期為受孕后9天，心臟和主動脈弓約為9～10天之間，腦約為10天，頭與脊椎骨約為11天，腭為12～13天，泌尿生殖器官約為15天。

   （二)劑量與效應關(guān)系較為復雜

1．  劑量效應關(guān)系復雜的表現(xiàn)及原因是：

   （1)機體在器官形成期間，與具有發(fā)育毒性的化合物接觸，可以出現(xiàn)畸形，但也可引起胚胎致死。當劑量增加時，毒性作用增強，但二者增強程度并不一定成比例，往往胚胎致死作用增強更較明顯，而致畸作用并不如此。由于胚胎死亡增加，畸胎數(shù)將因而減少。

   （2)某種致畸物可以引起一定的畸形，但在同一條件下，給衛(wèi)生資格考試網(wǎng)予更高的劑量，并不出現(xiàn)同一類型畸形�？赡苡捎谳^高劑量往往造成較為嚴重的畸形，較低劑量一般引起的輕度畸形，而嚴重畸形有時可將輕度畸形掩蓋。例如一種致畸物在低劑量時，可以誘發(fā)多趾，中等劑量時則誘發(fā)肢長骨縮短，高劑量時可造成缺肢或無肢。

   （3)許多致畸物除具有致畸作用外，還有可能同時出現(xiàn)胚胎死亡和生長遲緩；而且不同表現(xiàn)還可以相互影響，又無一定規(guī)律。

2．致畸作用的劑量反應曲線較為陡峭   最大無作用劑量與100%致畸劑量之間距離較小，一般相差1倍，曲線斜率也較大。往往100%致畸劑量即可出現(xiàn)胚胎死亡，劑量再增加，即引起母體死亡。還有人觀察到致畸作用最大無作用劑量與引起100%胚胎死亡的最低劑量僅相差2～3倍。例如劑量為5～10mg/kg體重的環(huán)磷酰胺給予受孕小鼠不表現(xiàn)致畸作用，但增加到40mg／kg體重，可引起100%胚胎死亡。

過低劑量不足以顯示確實存在的致畸作用，可得出錯誤的結(jié)論；劑量過高可使大量胚胎死亡或?qū)δ阁w毒性作用過強，都可影響結(jié)果的正確性。另外，評定一種致畸物對人體危害時，應充分考慮人體可能實際接觸的劑量。

   （三)物種差異以及個體差異在致畸作用中較為明顯

任何外來化合物的損害作用都存在物種以及個體差異，但在致畸作用中更較突出。同一致畸物在不同動物并不一定都具有致畸作用，引起畸形的類型也不一致。例如，殺蟲劑西維因?qū)﹄嗍缶哂兄禄�作用，對家兔和倉鼠并不致畸。農(nóng)藥二嗪農(nóng)和除草劑草完隆對豚鼠與家兔致畸，但對倉鼠未見致畸作用。反應停對人類以及其它靈長類動物具有強烈致畸作用，但對小鼠和家兔即使接觸較大劑量，其致畸作用仍極為輕微。

種間差異既同一物種中不同品系之間存在的差異，在致畸作用中也極明顯。同一物種動物的不同品系對一種致畸物敏感性的差別很大。例如，脫氫皮質(zhì)酮和生物染料錐蟲藍以及反應停都有這種現(xiàn)象。

致畸作用是發(fā)育毒性中最重要的一種表現(xiàn)，所以外來化合物發(fā)育毒性的評定，主要是通過致畸試驗。在致畸試驗中除可觀察到出生幼仔畸形外，也可同時發(fā)現(xiàn)生長發(fā)育遲緩和胚胎致死。傳統(tǒng)常規(guī)致畸試驗是評定外來化合物是否具有致畸作用的標準方法，多年來很多國家和機構(gòu)都采用和推薦這一方法。

   （一)傳統(tǒng)常規(guī)致畸試驗（致畸試驗)

1．動物選擇

致畸試驗的動物選擇，除參照毒性試驗中選擇動物的一般原則，即食性和對受試物代謝過程與人類接近，體型小，馴服，容易飼養(yǎng)和繁殖及價廉外，還應特別注意妊娠過程較短、每窩產(chǎn)仔數(shù)較多和胎盤構(gòu)造及厚度與人類接近等特點。

  根據(jù)上述原則綜合考慮，致畸試驗可選用二種哺乳動物，一般首先考慮大鼠，此外可采用小鼠或家免。大鼠受孕率高，每窩產(chǎn)仔8～10只，易于得到足夠標本數(shù)；而且經(jīng)驗證明，大鼠對大多數(shù)外來化合物代謝過程，基本與人類近似，故可首先考慮。但大鼠對一般外來化合物代謝速度，往往高于小鼠和家兔，以致對化學致畸物耐受性強、易感性低，有時出現(xiàn)假陰性。大鼠在器官發(fā)生期初期，其胎盤具有卵黃囊，稱為卵黃囊胎盤，在器官發(fā)生期后期，將轉(zhuǎn)變?yōu)榻q膜尿囊胎盤，有些外來化合物，例如錐蟲藍可以干擾通過卵黃囊胎盤對胚胎的正常營養(yǎng)過程，并因此致畸，出現(xiàn)陽性結(jié)果；而人類胎盤不具有卵黃囊胎盤階段，不存在同樣問題，所以有時此種結(jié)果對人類為假陽性。

小鼠自然畸形發(fā)生率較大鼠高，但低于家兔，對形成腭裂的致畸物更較敏感。家兔為草食動物，與人類代謝功能差異較大，妊娠期不夠恒定，有時延長至36天，自然畸形發(fā)生率也較高。

2．劑量分組

由于致畸作用的劑量效應（反應)關(guān)系曲線較為陡峭，斜率較大，最大無作用劑量與引起胚胎大量死亡以及母體中毒死亡的劑量極為接近。因此在確定劑量時，一方面要求找出最大無作用劑量以及致畸閾劑量；同時還要保持母體生育能力，不致大批流產(chǎn)和過多胚胎死亡；較多母體死亡也應避免。

一般應先進行預試，預試的目的是找出引起母體中毒的劑量。

根據(jù)預試結(jié)果可以確定正式試驗劑量。應最少設(shè)3個劑量組，另設(shè)對照組。原則上最高劑量組，可以引起母體輕度中毒，即進食量減少、體重減輕、死亡不超過10%。最低劑量組不應觀察到任何中毒癥狀；中間劑量組可以允許母體出現(xiàn)某些極輕微中毒癥狀。其劑量與高劑量和低劑量成等比級數(shù)關(guān)系。

一般最高劑量不超過LD₅₀的1/5～1/3，低劑量可為1／100～1／30。這一原則在預試中也可試用。如已掌握或能估計人體實際接觸量，也可將實際接觸量作為低劑量，并以其10倍左右為最高劑量。凡急性毒性較強的受試物，所采用劑量應稍低，反之可較高。也有人以亞慢性毒性試驗的最大無作用劑量為高劑量，并以其1／30為低劑量，可供參考。

每組動物大鼠或小鼠為12～20只，家兔8～12只，狗等大動物3～4只。在一般常規(guī)試驗中，除設(shè)有3個劑量組和一個對照組外，如受試物溶于某種溶劑或介質(zhì)中給予動物，則另設(shè)溶劑對照組。有時為了更好地驗證試驗結(jié)果，另設(shè)陽性對照組，按大鼠每kg體重15 000IU維生素A劑量，或?qū)⒚縨l含50 000IU維生素A的濃魚肝油，按每100g體重1 ml劑量給大鼠灌胃。此外敵枯雙、五氯酚鈉等也可采用。

3．動物交配處理 

將性成熟雌雄動物按雌雄l：1或2：1比例同籠交配。每日將已確定受孕雌鼠隨機分入各劑量組和對照組。確定受孕方法是陰栓檢查或陰道涂片精子檢查。出現(xiàn)陰栓或精子之日即為受孕0日，也有人作為第1日。準確確定受孕日對精確掌握動物接觸受試物時間、最后處死動物及確定進行檢查的日期非常重要。

 由于致畸作用有極為明確的敏感期，應精確掌握動物接觸受試物的時間，必須在器官發(fā)生期。如提前在著床前接觸，將影響受精卵的著床。如在胚胎發(fā)育的最初階段，例如裂卵期和囊胚期接觸受試物，往往可使胚胎死亡，不能造成畸形。如在器官發(fā)生期以后接觸受試物，則各種器官已發(fā)育成熟，致畸作用不易表現(xiàn)。只有器官發(fā)生期的胚胎，對致畸物最為敏感，易于出現(xiàn)畸形。

大鼠和小鼠一般可自受孕后第5天開始給予受試物，每日一次，持續(xù)到第15天。如擬深入研究何種器官對受試物更為易感，則應在上述期間將受試物每日分別給予一批動物，每批動物只接觸受試物一次，最后可以根據(jù)畸形出現(xiàn)的情況，確定受試物的主要靶器官。

  接觸受試物的方式與途徑應與人體實際接觸情況一致，一般多經(jīng)口給予。也可采用灌胃方式，以保證劑量準確，效果較混入飼料喂給為好。在特殊情況下，也可采用腹腔注射法，效果與經(jīng)口近似。

  試驗期間每2～3天稱取母鼠體重。一方面可根據(jù)體重增長，隨時調(diào)整給予受試物的劑量，同時也可觀察受孕動物的妊娠情況和胚胎發(fā)育情況。受孕動物的體重如持續(xù)增長，則表示妊娠過程及胚胎發(fā)育正常；如體重停止增長或下降，可能由于受試物的毒性作用或母體的其它原因，引起胚胎死亡或流產(chǎn)。

4．胎仔檢查

自然分娩前1～2日將受孕動物處死，剖腹取出子宮及活產(chǎn)胎仔，并另行記錄死胎及吸收胎。一般大鼠在受孕后第19～20天，小鼠第18～19天，家兔在第29天。

活產(chǎn)胎仔取出后，先檢查性別，逐只稱重，并按窩計算平均體重，然后由下列幾方面進行畸形檢查：①外觀畸形肉眼檢查，例如露腦；②肉眼檢查內(nèi)臟及軟組織畸形，例如腭裂；③骨骼畸形檢查，例如顱頂骨缺損，分叉肋等�；�形檢查只限活產(chǎn)胎仔。

以上檢查只能檢出結(jié)構(gòu)與形態(tài)異常的畸形，不能檢出可能發(fā)生的生化功能或神經(jīng)行為缺陷。因此有人主張將試驗雌鼠保留1/4左右，待其自然分娩，并將出生幼仔飼養(yǎng)觀察，至少到斷奶，以便檢查可能存在的先天缺陷和生理功能異常。

5．結(jié)果評定

在致畸試驗結(jié)果評定時，主要計算畸胎總數(shù)和畸形總數(shù)。計算畸胎總數(shù)時，每一活產(chǎn)幼仔出現(xiàn)一種或一種以上畸形均作為一個畸胎。計算畸形總數(shù)時，在同一幼仔每出現(xiàn)一種畸形，即作為一個畸形；如出現(xiàn)二種或二個畸形，則作為二個畸形計，并依此類推。計算時還要對劑量效應（反應)關(guān)系加以分析。更重要的是按下列指標將各劑量組與對照組結(jié)果進行比較。

（1)活產(chǎn)幼仔平均畸形出現(xiàn)數(shù)： 即根據(jù)出現(xiàn)的畸形總數(shù)，計算每個活產(chǎn)幼仔出現(xiàn)的畸形平均數(shù)。對較為重要的畸形，還可分別單獨進行計數(shù)。

     畸形總數(shù)

   活產(chǎn)幼仔平均畸形出現(xiàn)數(shù)= ———————————

活產(chǎn)幼仔總數(shù)

（2)畸形出現(xiàn)率：即作為畸胎的幼仔在活產(chǎn)幼仔總數(shù)中所占的百分率。

     出現(xiàn)畸形的胎仔總數(shù)

  畸胎出現(xiàn)率= ———————————  × 100%

活產(chǎn)胎仔總數(shù)

   （3)母體畸胎出現(xiàn)率：即出現(xiàn)畸形胎仔的母體在妊娠母體總數(shù)中所占的百分率。計算出現(xiàn)畸形母體數(shù)時，同一母體無論出現(xiàn)多少畸形胎仔或多少種畸形，一律按一個出現(xiàn)畸胎的母體計算。

   出現(xiàn)畸胎的母體數(shù) 

  母體畸胎出現(xiàn)率= ———————————× 100% 

妊娠母體數(shù)

6．致畸物以及發(fā)育毒性作用物危險度評定

   （1)歐共體（EEC)和經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（OECD)建議的致畸物分級標準。主要根據(jù)動物試驗和人群調(diào)查資料，具體分級標準：

1級， 已確定人類母體接觸后可引起子代先天性缺陷；

2A級，對動物肯定致畸，但對人類致畸作用尚未確定因果關(guān)系；

2B級，動物試驗結(jié)果肯定致畸，但無人類致畸資料；

3 級，尚無結(jié)論性肯定致畸證據(jù)或資料不足；

    4級， 動物試驗陰性，人群中調(diào)查結(jié)果未發(fā)現(xiàn)致畸

  （2)致畸指數(shù)： 母體LD₅₀與胎仔最小致畸作用劑量之比，即母體LD₅₀／胎仔最小致畸作用劑量。這一比值愈大，致畸作用愈強，一般認為比值10以下者，不具致畸作用，10～100具致畸作用，100以上致畸作用強烈。

  （3)相對致畸指數(shù)（RTI)：成年動物最小致死劑量（LD₀₁)與引起5%活產(chǎn)胎仔出現(xiàn)畸形的劑量（tD₀₅)之比值，即LD₀₁／ LD₀₅。