第八章　色譜分析法概論

第一節(jié)  概述

色譜法（chromatography)是一種對(duì)混合物進(jìn)行分離分析的方法。由于色譜法具有很強(qiáng)的分離能力，加上現(xiàn)代色譜檢測(cè)器具有很高的靈敏度，色譜法已成為分離分析復(fù)雜混合物的最重要手段，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生、食品、環(huán)境、材料、化工、農(nóng)業(yè)及生命科學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。本章在介紹色譜法基本概念和方法的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)介紹經(jīng)典液相色譜法

一、色譜法的發(fā)展

色譜法創(chuàng)始于20payment-defi.com/sanji/世紀(jì)初，1906年，俄國植物學(xué)家Tswett在研究植物色素時(shí)，將植物色素的石油醚提取液通過裝有碳酸鈣的玻璃管，再用石油醚淋洗，發(fā)現(xiàn)在柱管上形成了不同顏色的色帶。管內(nèi)填充物稱為固定相（stationaryphase)，淋洗劑稱為流動(dòng)相（mobile phase)，而填充有固定相的管柱被稱為色譜柱（column)。分段收集從管柱中洗脫出的各色帶的洗脫液，便可分離得到石油醚提取液中的葉綠素、葉黃素、胡蘿卜素等各種色素。Tswett把這種分離方法稱為色譜法。后來，這種方法也用來分離無色物質(zhì)，但色譜一詞仍沿用至今。也有人稱之為層析法。

自從Tswett建立以吸附劑為固定相的吸附柱色譜法以來，色譜法至今已有一個(gè)世紀(jì)的歷史。在這期間，先是經(jīng)歷了經(jīng)典液相色譜法的發(fā)展過程。1935年出現(xiàn)了用離子交換劑作固定相的離子交換柱色譜法，在1941年Martin及Synge發(fā)明了以液體為固定相的分配柱色譜法， 1944年Martin等人用濾紙作分配色譜的載體，建立了紙色譜法，1956年出現(xiàn)了薄層色譜法，1959年又出現(xiàn)了凝膠柱色譜法。在二十世紀(jì)五十年代后，現(xiàn)代色譜法逐步建立和發(fā)展起來。1952年Martin等人以氣體作流動(dòng)相，建立了氣相色譜法，這一年，Martin因其在色譜領(lǐng)域所做出的杰出貢獻(xiàn)獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。1968年前后產(chǎn)生了高效液相色譜法。在二十世紀(jì)六十至八十年代，產(chǎn)生了超臨界流體色譜法和毛細(xì)管柱色譜法。在各種類型色譜方法建立的同時(shí)，色譜理論也趨于成熟，Martin和Synge在建立分配色譜法的同時(shí)，提出了表達(dá)柱效能模式的塔板理論；在氣相色譜法興起后， Van Deemter等人又提出了速率理論，結(jié)合氣相色譜法的色譜過程，分析和總結(jié)了影響柱效能的因素。速率理論為氣相色譜法的實(shí)踐提供了理論指導(dǎo)，同時(shí)，也為高效液相色譜法的創(chuàng)建提供了啟迪和依據(jù)。

二、色譜法的分類

色譜法種類很多，可從不同的角度對(duì)其進(jìn)行分類。

1. 按流動(dòng)相和固定相的物理狀態(tài)分類　在色譜法中，流動(dòng)相可以采用氣體、液體或超臨界流體。根據(jù)流動(dòng)相的物理狀態(tài)，可分為氣相色譜法（gas chromatography,GC)、液相色譜法（liquidchromatography, LC)和超臨界流體色譜法（supercriticalfluid chromatography, SFC)。在氣相色譜法中，固定相為固體吸附劑的稱為氣固色譜法，固定相為液體（涂布在擔(dān)體表面或毛細(xì)管壁)的稱為氣液色譜法；在液相色譜法中，固定相為固體吸附劑的稱為液固色譜法，固定相為液體（涂布在擔(dān)體表面)的稱為液液色譜法。此外，將采用化學(xué)鍵合固定相的色譜法稱為鍵合相色譜法（bondedphase chromatography, BPC)。

2. 按操作形式分類　固定相裝在管柱內(nèi)的色譜法稱為柱色譜法（column chromatography)。按照管柱的粗細(xì)和固定相的填充方式又分為填充柱色譜法（packedcolumn chromatography)和毛細(xì)管柱色譜法（capillarycolumn chromatography)。

固定相呈平面狀的色譜法稱為平面色譜法（planar chromatography)。按平面色譜材料不同，又可分為薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC)和紙色譜法（paper chromatography)。

3. 按色譜過程的分離機(jī)理分類

（1)吸附色譜法（adsorption chromatography)：根據(jù)不同組分在吸附劑（固定相)上吸附能力不同而進(jìn)行分離的色譜方法。如氣固色譜法、液固色譜法。

（2)分配色譜法（partitionchromatography)：根據(jù)不同組分在固定相（液體)和流動(dòng)相之間分配系數(shù)的不同而進(jìn)行分離的色譜方法。如氣液色譜法、液液色譜法。

（3)離子交換色譜法（ion exchange chromatography)：根據(jù)不同組分離子對(duì)離子交換劑（固定相)的親和力不同而進(jìn)行分離的色譜方法。

（4)尺寸排阻色譜法（sizeexclusion chromatography)：又稱凝膠色譜法（gel chromatography)，根據(jù)不同大小的組分分子在多孔性凝膠（固定相)中的選擇性滲透而進(jìn)行分離的色譜方法。

（5)親和色譜法（affinitychromatography)：根據(jù)不同組分與固定化分子（固定相)的高專屬性親和力進(jìn)行分離的色譜方法。在此基礎(chǔ)上，又發(fā)展產(chǎn)生了生物色譜法（biochromatography)。生物色譜法采用各種具有生物活性的材料（例如：酶、載體蛋白、細(xì)胞膜、活細(xì)胞等)作固定相，是利用固定相與各種生物活性物質(zhì)的選擇性結(jié)合而進(jìn)行分離的色譜方法。

三、色譜法的基本原理

（一)色譜分離過程

在色譜分離過程中，當(dāng)流動(dòng)相攜帶試樣對(duì)固定相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，由于試樣中各組分在固定相和流動(dòng)相之間的作用力（如吸附力、溶解力、離子交換力、分子排阻力和親和力等)有微小差別，使得不同組分被流動(dòng)相運(yùn)載移動(dòng)的速率不同，產(chǎn)生差速遷移（differential migration)，從而使性質(zhì)有微小差異的不同組分被分離。差速遷移是色譜分離的基礎(chǔ)。

以吸附柱色譜法為例，如圖8-1所示。

圖8-1色譜分離過程示意圖

當(dāng)試樣加到裝有吸附劑顆粒的色譜柱頂端，試樣中各種組分便被固定相吸附，再向色譜柱中不斷加入流動(dòng)相（洗脫劑)，當(dāng)流動(dòng)相通過固定相顆粒空隙時(shí)，已被吸附在固定相的試樣組分又溶于流動(dòng)相中而被解吸，并隨著流動(dòng)相向前移行，已解吸的試樣組分遇到新的固定相顆粒，又再次被吸附。如此，在色譜柱上發(fā)生反復(fù)多次的吸附-解吸或分配過程。由于各種組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同，固定相對(duì)它們的吸附力大小不同，在色譜柱上的保留作用也就不同。與固定相作用力較弱的組分在色譜柱上的保留作用較小，在色譜柱中遷移速率較快，先流出色譜柱；與吸附劑作用力較強(qiáng)的組分在色譜柱上的保留作用較大，在色譜柱中遷移速率較慢，后流出色譜柱。于是，試樣中的各個(gè)組分便被色譜柱分離。

由色譜分離過程可知，色譜法是利用混合物中各組分在兩相（固定相與流動(dòng)相)中吸附、分配、離子交換、親和力、分子尺寸等的差異，使固定相對(duì)各組分保留作用不同，產(chǎn)生差速遷移而進(jìn)行分離分析的方法。

第二節(jié)  經(jīng)典液相柱色譜法

經(jīng)典液相色譜法，包括各種柱色譜法、紙色譜法、薄層色譜法等，具有樣品容量大、所需設(shè)備簡單、操作方便、成本低等特點(diǎn)，所以適用于試樣的分離和提純，也可作初步的定性和定量分析。

一、吸附柱色譜法

吸附柱色譜法以固體吸附劑為固定相，所以又稱液固色譜法。吸附柱色譜法是最早建立的液相色譜法。

（一)吸附柱色譜法的基本原理

1.吸附作用和吸附平衡

吸附柱色譜法的固定相是吸附劑。吸附劑通常是具有較大比表面積的多孔性固體顆粒物質(zhì)，在它的表面存在著許多分散的吸附點(diǎn)位。當(dāng)試樣中的組分分子（X)被流動(dòng)相帶入色譜柱后，在固定相表面的吸附點(diǎn)位上將發(fā)生組分分子（X)與吸附在固定相上的流動(dòng)相分子（M)的競爭吸附，直到組分分子被吸附到固定相上的速度與其從固定相上解吸下來的速度相等時(shí)，達(dá)到吸附平衡。

吸附平衡及吸附平衡常數(shù)K_ad可表示如下：

    （8－1)

式中，、分別為組分分子和流動(dòng)相分子在固定相表面的平衡濃度；、分別為組分分子和流動(dòng)相分子在流動(dòng)相中的平衡濃度。吸附平衡常數(shù)K_ad是評(píng)價(jià)色譜柱對(duì)某個(gè)試樣組分保留能力的一個(gè)參數(shù)。

若某組分的K_ad值較大，表明該組分在兩相中達(dá)到吸附平衡時(shí)，該組分在固定相中的保留作用較強(qiáng)，難以洗脫；若某組分的K_ad值較小，則表明該組分在兩相中達(dá)到吸附平衡時(shí)，該組分在固定相中的保留作用較弱，易于洗脫。不同組分，由于其K_ad值不同，所以在色譜過程中彼此分離。

2.   吸附等溫線

在一定溫度下，組分在吸附劑表面被吸附達(dá)到平衡時(shí)，組分在兩相中濃度相對(duì)關(guān)系的曲線，稱為吸附等溫線（adsorption isotherm)。它用于描述組分在吸附劑上的吸附規(guī)律。吸附等溫線的橫坐標(biāo)為組分在流動(dòng)相中的濃度，縱坐標(biāo)為被吸附在固定相表面的組分的濃度。

吸附等溫線通常有直線型、凸線型和凹線型三種（見圖8－2)。

圖8－2  三種吸附等溫線

（1)直線型等溫線：這是理想的吸附等溫線。直線斜率是一恒定常數(shù)，相當(dāng)于某組分在兩相中的吸附平衡常數(shù)K_ad恒定。吸附色譜出現(xiàn)直線型等溫線的情況較少。

（2)凸線型等溫線：在吸附色譜法中，當(dāng)組分濃度較高時(shí)，容易出現(xiàn)凸線型等溫線。凸線型等溫線形成原因是：吸附劑表面常有多種吸附力不同的吸附點(diǎn)位，組分分子總是先占據(jù)吸附力強(qiáng)的點(diǎn)位，然后再占據(jù)吸附力弱的點(diǎn)位。這樣，在組分濃度較低時(shí)，被吸附劑吸附得較牢固，較難洗脫；而在組分濃度較高時(shí)，在固定相上吸附較松弛，易洗脫。

（3)凹線型等溫線： 吸附色譜出現(xiàn)凹線型等溫線的情況較少。當(dāng)組分濃度較高時(shí)，有時(shí)會(huì)在吸附過程中發(fā)生另外的一些反應(yīng)，例如，已被吸附劑吸附的組分分子會(huì)通過氫鍵作用而吸附更多的組分分子，使得吸附劑對(duì)組分的吸附力增強(qiáng)。這樣，在組分濃度較高時(shí)，吸附較強(qiáng)，較難洗脫。

其實(shí)，在凸線型或凹線型等溫線中，當(dāng)試樣組分在流動(dòng)相中的濃度較低時(shí)，即在等溫線的起始部分，曲線近似為直線。也就是說，吸附等溫線僅在較低的濃度范圍內(nèi)呈線性。

（二)固定相和流動(dòng)相

  1. 固定相

對(duì)吸附劑的基本要求是：吸附劑的粒度均勻、大小適當(dāng)，有一定機(jī)械強(qiáng)度；具有較大的比表面積，吸附點(diǎn)位的吸附能力大小均勻；不與流動(dòng)相以及被測(cè)組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，也不溶于流動(dòng)相。

常用的吸附劑可分為極性和非極性兩大類。極性吸附劑包括各種無機(jī)氧化物，如硅膠、氧化鋁、氧化鎂、硅酸鎂及分子篩等；非極性吸附劑最常見的是活性炭。

（1)硅膠（SiO₂·xH₂O)：硅膠具有微酸性，適用于分離酸性和中性物質(zhì)，是柱色譜法和薄層色譜法最常用的吸附劑。硅膠為多孔性硅氧烷交聯(lián)結(jié)構(gòu)，表面具有硅羥基活性基團(tuán)，可與極性化合物或不飽和有機(jī)化合物形成氫鍵而具有吸附性。硅羥基也能與水形成氫鍵結(jié)合，生成水合硅羥基。由于硅羥基已與水之間形成氫鍵，不再具有吸附其它物質(zhì)的能力，使硅膠的吸附能力降低，或失去吸附活性（稱為失活)。當(dāng)加熱到100 ℃左右時(shí)，硅膠表面吸附的水（稱為“自由水”)能被可逆地除去，使硅膠的吸附能力恢復(fù)。硅膠加熱去水的過程稱為活化（activation)。硅膠的活化溫度要適宜，一般為110 ℃左右，加熱30 min。如果活化溫度太高，當(dāng)超過500 ℃時(shí)，會(huì)使硅羥基失去一個(gè)水分子（稱為“結(jié)構(gòu)水”)，不可逆地變成硅氧烷結(jié)構(gòu)，反而使硅膠失去吸附活性。

（2)氧化鋁：是一種吸附能力較強(qiáng)的吸附劑。供柱色譜法使用的氧化鋁有酸性、中性和堿性三種。酸性氧化鋁適用于酸性色素、羧酸、氨基酸等酸性化合物和對(duì)酸穩(wěn)定的中性化合物的分離。堿性氧化鋁適用于生物堿、胺類等堿性化合物和一些中性化合物的分離。中性氧化鋁適用于烴、生物堿、萜類、甾族、甙類、酯、內(nèi)酯、醛、酮、醌等類化合物的分離，凡是酸性或堿性氧化鋁可以分離的化合物，都能用中性氧化鋁分離。

氧化鋁的吸附能力也與其含水量有很大關(guān)系。含水量越高，吸附能力越小，即活性越低。所以，氧化鋁也可以通過加熱除水進(jìn)行活化。通�？蓪⒀趸�鋁置于約400 ℃的電爐內(nèi)，恒溫加熱6 h，取出后，放入密閉的干燥器備用。使用時(shí)可根據(jù)所需活性大小適量加水。

氧化鋁及硅膠的活性都與含水量有關(guān)，活性的強(qiáng)弱用活度級(jí)別表示，活度級(jí)別的數(shù)值越小，其活性越強(qiáng)，吸附劑的含水量越低。硅膠、氧化鋁的含水量與活性關(guān)系見表 8－1。

表8－1  硅膠、氧化鋁的含水量與活性關(guān)系

吸附劑選擇的基本原則是：分離弱極性物質(zhì)，一般選用活性較強(qiáng)的吸附劑；分離強(qiáng)極性物質(zhì)，應(yīng)選用活性較弱的吸附劑。

2．流動(dòng)相

（1)對(duì)流動(dòng)相的基本要求： 純度合格，否則，所含雜質(zhì)會(huì)干擾試樣組分的分離；能溶解試樣，但不與試樣以及吸附劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；粘度小，能保持一定的洗脫速率；性質(zhì)穩(wěn)定，有一定的揮發(fā)性，對(duì)分離組分的回收沒有干擾。

（2)流動(dòng)相的選擇： 流動(dòng)相的洗脫能力主要由其極性決定。由于在吸附色譜過程中，流動(dòng)相分子與試樣組分分子競爭吸附劑表面的吸附點(diǎn)位，強(qiáng)極性的流動(dòng)相分子占據(jù)吸附點(diǎn)位的能力強(qiáng)，其洗脫能力強(qiáng)，使試樣組分的K_ad值小，保留時(shí)間短。溶劑洗脫能力可用Snyder提出的溶劑強(qiáng)度e⁰表示，e⁰為溶劑分子在單位吸附劑表面上的吸附自由能。通常，溶劑的e⁰越大，則溶劑的極性越大，固定相對(duì)溶劑的吸附作用力也就越大，溶劑的洗脫能力也就越強(qiáng)。表8－2列出一些溶劑在氧化鋁上的e⁰值。

表8－2 一些溶劑在氧化鋁上的e⁰值

由于各種溶劑的e⁰值間隔較大，對(duì)于多組分復(fù)雜混合物的分離，難以用一種溶劑實(shí)現(xiàn)。為了得到適當(dāng)溶劑強(qiáng)度的流動(dòng)相，可用兩種以上的溶劑，按一定的比例組成混合流動(dòng)相，通過改變流動(dòng)相的性質(zhì)和組成來實(shí)現(xiàn)較好的分離。

通�？梢愿鶕�(jù)“相似相溶”的原則選擇流動(dòng)相。對(duì)極性大的試樣采用極性較強(qiáng)的流動(dòng)相；對(duì)極性小的試樣則采用極性較弱的流動(dòng)相。

吸附柱色譜法對(duì)于不同族化合物的分離能力較強(qiáng)，對(duì)同分異構(gòu)體的分離效果也較好，但對(duì)同系物分離的選擇性較差。一般不適宜分離強(qiáng)極性化合物。

二、分配柱色譜法 

在分配柱色譜法中，固定相和流動(dòng)相均為液體，故又稱為液液色譜法。根據(jù)固定相和流動(dòng)相極性的不同，可分為正相色譜法和反相色譜法。當(dāng)固定相的極性強(qiáng)于流動(dòng)相的極性時(shí)，稱為正相色譜法，反之稱為反相色譜法。分配柱色譜法與吸附柱色譜法相比，具有適用范圍廣的優(yōu)點(diǎn)。

（一)分離原理

分配柱色譜法的分離原理是根據(jù)被分離的各個(gè)組分在互不相溶的固定相和流動(dòng)相中溶解度不同，即不同組分在兩相中達(dá)到分配平衡時(shí)具有不同的分配系數(shù)來實(shí)現(xiàn)的。在試樣組分隨流動(dòng)相移動(dòng)通過色譜柱的過程中，組分在兩相中不斷建立、打破和重新建立分配平衡。各組分由于具有不同的分配系數(shù)，它們?cè)谥�中發(fā)生了許多次的分配平衡后，就產(chǎn)生了差速遷移，從而得到分離。

（二)固定相和流動(dòng)相

1. 固定相

分配柱色譜法的固定相就是涂布在惰性載體表面上的固定液。要求所選用的固定液對(duì)待分離組分是一種良好的溶劑，而不溶或很難溶于流動(dòng)相。在分配色譜法中，常用的固定液有甲醇、甲酰胺、聚乙二醇、辛烷、硅油和角鯊?fù)榈取?/h2>

固定液的載體又稱擔(dān)體，載體起負(fù)載固定液的作用，要求載體是惰性、多孔、有較大表面積的固體顆粒。常用的載體有硅膠、纖維素、多孔硅藻土等。

2. 流動(dòng)相在分配色譜法中，由于流動(dòng)相也參與被分離組分的分配作用，流動(dòng)相極性的微小變化都會(huì)使組分的保留值出現(xiàn)較大的改變，因此，經(jīng)常通過選擇適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)相來達(dá)到預(yù)期的分離效果。

在分配柱色譜法中，要求流動(dòng)相純度高、粘度小、盡可能不與固定相互溶，即流動(dòng)相與固定液之間極性差別越大越好。此外，為防止固定液的流失，流動(dòng)相在使用前，須預(yù)先使流動(dòng)相中溶解的固定液達(dá)到飽和。

在分配柱色譜法中，對(duì)于被分離組分，固定液是一種溶解度較大的溶劑，而流動(dòng)相是一種溶解度較小的溶劑。這樣可使固定相對(duì)各組分有較好的保留，從而固定相對(duì)各組分保留的差異也就比較大，因此，各組分能獲得良好的分離。根據(jù)這個(gè)原則，針對(duì)不同極性的被分離物質(zhì)，可選用不同類型的分配柱色譜法。

三、離子交換色譜法

離子交換色譜法是利用被分離組分離子在固定相上親和性的差異而進(jìn)行分離的液相色譜方法。離子交換色譜法適用于離子型化合物的分離，在無機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)和醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域中都有廣泛的應(yīng)用。

（一)離子交換色譜法原理

在離子交換色譜法中，常用離子交換樹脂作固定相。離子交換樹脂為具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子聚合物（骨架部分)，并帶有活性基團(tuán)�；钚曰鶊F(tuán)由兩部分組成，一部分為帶負(fù)電荷的陰離子基團(tuán)或帶正電荷的陽離子基團(tuán)，如磺酸基（－SO₃^－)或季胺基（－N^＋（CH₃)₃)等，為不可交換的離子基團(tuán)；另一部分為這些離子基團(tuán)上結(jié)合的與其電性相反的離子，如 H^＋或OH^-等，為可交換離子。根據(jù)可交換離子的電荷極性不同，離子交換樹脂分為陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂，相應(yīng)的色譜方法分別稱為陽離子交換色譜法和陰離子交換色譜法。在離子交換色譜法的分離過程中，被分離物質(zhì)在流動(dòng)相中電離產(chǎn)生的組分離子，與固定相上的可交換離子進(jìn)行可逆交換。由于試樣中各種被測(cè)離子與離子交換樹脂的相互作用（或稱親和力)不同，與離子交換樹脂親和力強(qiáng)的被測(cè)離子在固定相中保留時(shí)間較長，而與離子交換樹脂親和力弱的被測(cè)離子在固定相中保留時(shí)間較短，這樣，試樣的各組分在反復(fù)進(jìn)行的離子交換色譜過程中產(chǎn)生差速遷移，因而得到分離。

（二)固定相和流動(dòng)相

  1.固定相

離子交換色譜法的固定相稱為離子交換劑，通常使用合成的離子交換樹脂和離子交換纖維素作固定相。

（1) 離子交換劑種類  按活性基團(tuán)的不同，離子交換劑可分為四種：

1)強(qiáng)酸性陽離子交換劑（活性基團(tuán)為—SO₃H)；

2)弱酸性陽離子交換劑（活性基團(tuán)為—COOH)；

3)強(qiáng)堿性陰離子交換劑（活性基團(tuán)為—N⁺R₃X^-)；

4)弱堿性陰離子交換劑（活性基團(tuán)為—NH₂，—NHR或—NR₂)。

（2)離子交換樹脂的指標(biāo)

1)交聯(lián)度（degree of cross linking )：離子交換樹脂中交聯(lián)劑的含量稱為交聯(lián)度，以質(zhì)量百分比表示，不同品種樹脂的交聯(lián)度范圍為1%~16%。如應(yīng)用最廣泛的聚苯乙烯型合成樹脂，它是以二乙烯苯作為交聯(lián)劑，將聚乙烯直鏈交聯(lián)起來而形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的聚合物。交聯(lián)度與樹脂的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上的網(wǎng)孔大小有關(guān)：若交聯(lián)度大，表明樹脂網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)緊密，網(wǎng)孔小，大離子不易進(jìn)入樹脂內(nèi)部，離子交換速度慢，選擇性好，適用于分子量較小的離子性物質(zhì)分離；若交聯(lián)度小，則樹脂網(wǎng)孔大，交換速度快，選擇性差，適用于分子量較大的離子性物質(zhì)分離。

2)交換容量（exchange capacity)：每克干樹脂能參加交換反應(yīng)的活性基團(tuán)數(shù)稱為交換容量，單位為mmol/g或mmol/ml，交換容量反映樹脂交換反應(yīng)的能力。

3)粒度：用樹脂溶脹后能通過的篩孔目數(shù)表示離子交換樹脂粒度的大小。制備純水用的離子交換樹脂粒度一般為10～50目，色譜分析用的離子交換樹脂粒度一般為100～200目。

2. 流動(dòng)相

離子交換色譜法的流動(dòng)相通常為緩沖溶液�？赏ㄟ^調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值或離子強(qiáng)度，調(diào)整試樣組分的保留值。流動(dòng)相pH值的變化，能導(dǎo)致離子型化合物在溶液中電離程度發(fā)生變化。如果電離度增大，則試樣組分以離子形式存在的比例增大，試樣組分的保留值也增大。如果增加流動(dòng)相中其它鹽離子濃度，即增大流動(dòng)相的離子強(qiáng)度，則削弱了試樣組分離子的競爭交換能力，使試樣組分離子的保留值降低。此外，如果在流動(dòng)相中加入甲醇或乙醇等有機(jī)溶劑，也可調(diào)節(jié)試樣組分的保留值。

四、尺寸排阻色譜法

尺寸排阻色譜法(sizeexclusion chromatography )又稱凝膠色譜法(gel chromatography)，或空間排阻色譜法等。它是以多孔性凝膠填料為固定相，按分子大小順序分離試樣中各組分的液相色譜法。對(duì)于水溶性試樣采用水溶液為流動(dòng)相，稱為凝膠過濾色譜法(gel filtration chromatography)；對(duì)于非水溶性試樣采用有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，稱為凝膠滲透色譜法(gel permeation chromatography)。尺寸排阻色譜法主要應(yīng)用于分離高分子化合物，常用于分離提純生物高分子（如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等)化合物，除去其溶液中低分子量雜質(zhì)。

（一)分離原理

尺寸排阻色譜法是依據(jù)被分離組分分子的尺寸和形狀不同來實(shí)現(xiàn)分離的。尺寸排阻色譜法的固定相為化學(xué)惰性、具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴。根據(jù)被分離試樣組分分子的大小，選用具有相應(yīng)孔穴大小的凝膠作固定相。當(dāng)試樣組分進(jìn)入色譜柱時(shí)，體積大于凝膠孔穴的試樣組分分子不能滲透到孔穴中，因此不被固定相保留，較早地隨流動(dòng)相流出色譜柱；體積小于凝膠孔穴的試樣組分分子可滲透進(jìn)入凝膠孔穴，這些組分分子依據(jù)其分子的不同大小分別滲入到凝膠孔穴的不同深度，并被固定相程度不同地保留，其中體積較大的組分分子在色譜柱中保留時(shí)間較短，而體積較小的組分分子在色譜柱中保留時(shí)間較長，從而使試樣組分分子按其分子大小先后從柱中流出，得以分離。

（二)固定相和流動(dòng)相

尺寸排阻色譜法固定相種類很多，葡聚糖凝膠是最常用的固定相，商品名為Sephadex，它由葡聚糖經(jīng)稀鹽酸降解后，用環(huán)氧丙烷交聯(lián)制成。葡聚糖凝膠的交聯(lián)度與其吸水量和機(jī)械強(qiáng)度有關(guān)。凝膠的交聯(lián)度越小，其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的孔隙就越大，所以吸水溶脹的程度就越大，其機(jī)械強(qiáng)度就越小。交聯(lián)度可用每克干凝膠吸收水分的重量來表示，商品型號(hào)用含水量的十倍表示，如含水量為7.5 g/g的葡聚糖凝膠的商品名為Sephadex G75。根據(jù)凝膠的交聯(lián)度或含水量可判別凝膠的機(jī)械強(qiáng)度。通常將吸水量>7.5 g/g的凝膠歸屬為軟質(zhì)凝膠（軟膠)，如Sephadex G100、G150、G200等；而將吸水量<7.5 g/g的凝膠歸屬為剛性凝膠（硬膠)，如Sephadex G15、 G25、G50等。軟質(zhì)凝膠適用于水溶液體系，只能在較低的流速和柱壓下使用，主要用于分離生物高分子，如酶、蛋白質(zhì)、核酸以及多糖類。剛性凝膠適用于有機(jī)溶劑系統(tǒng)，適于在較高壓力下使用，常用于從大分子物質(zhì)中除去小分子雜質(zhì)。除了葡聚糖凝膠以外，常用的凝膠還有瓊脂糖凝膠、聚苯乙烯凝膠、聚丙烯酰胺凝膠以及多孔硅膠、多孔玻璃等。

尺寸排阻色譜法的流動(dòng)相必須能溶解試樣，粘度低，與凝膠的浸潤性好。當(dāng)采用軟質(zhì)凝膠時(shí)，流動(dòng)相必須能使凝膠溶脹。常用的流動(dòng)相有四氫呋喃、甲苯、二氯乙烷、三氯甲烷、苯、二甲基酰胺和水等。 執(zhí)業(yè)醫(yī)師

第三節(jié) 平面色譜法

上一節(jié)中介紹的液相柱色譜法，其固定相是填充在管柱中的，固定相也可以涂鋪或結(jié)合在平面載體上，這類液相色譜法被稱為平面色譜法  (planar chromatography)。平面色譜法包括薄層色譜法和紙色譜法。

一、薄層色譜法

薄層色譜法是將被分離的試樣溶液點(diǎn)在薄層板的一端，再用溶劑把試樣展開，從而使試樣組分分離。薄層色譜法根據(jù)所采用的固定相及其分離原理不同，可分為吸附、分配、離子交換及凝膠色譜等類型。其中采用吸附劑作固定相的吸附薄層色譜法應(yīng)用最廣泛。

（一)薄層色譜法的原理

現(xiàn)以吸附薄層色譜法為例說明薄層色譜法的原理，將一定粒度的吸附劑均勻地涂鋪在表面光潔的玻璃或塑料平板上，制成薄層板。然后把待分析試樣的溶液滴加在薄層板一端的起始線上（稱為點(diǎn)樣，樣點(diǎn)稱為原點(diǎn))。再把點(diǎn)樣后的薄層板放入密閉容器（稱為層析缸)中，使薄層板的底端浸入適當(dāng)?shù)娜軇�（流�?dòng)相，稱為展開劑)。展開劑在薄層的毛細(xì)管作用下，緩緩地在薄層上向前移動(dòng)，當(dāng)展開劑經(jīng)過原點(diǎn)時(shí)，就帶著試樣組分一起向前移動(dòng)（稱為展開)。在展開過程中，組分在兩相之間發(fā)生多次吸附-解吸平衡。由于吸附劑對(duì)不同組分的吸附能力不同，所以不同的組分向前移動(dòng)的速率不同，展開一定時(shí)間后，不同組分互相分離，在薄層板上形成不同距離的斑點(diǎn)。各組分在薄層上的位置用比移值（retardation factor, retentionfactor, R_f)表示（見圖8－3)。

（8－2)

式中，a為原點(diǎn)中心至斑點(diǎn)中心的距離；C為原點(diǎn)中心至溶劑前沿的距離。

圖8-3  R_f值測(cè)量示意圖

R_f值相差越大，則分離越好。一般要求分離后組分的R_f值在0.2～0.8之間，各組分的R_f值之差應(yīng)大于0.05，以防斑點(diǎn)重疊。

影響R_f值的因素較多，在實(shí)際工作中，由于色譜操作條件較難完全一致，R_f值難以重復(fù)。為消除因色譜操作條件而引起的誤差，有人提議采用相對(duì)比移值R_st定性，使定性結(jié)論更為可靠。R_st定義為：

     （8－3)

式中，a為原點(diǎn)中心至待測(cè)物質(zhì)斑點(diǎn)中心的距離；b為原點(diǎn)中心至參考物質(zhì)斑點(diǎn)中心的距離。

（二)固定相和流動(dòng)相

   1．固定相

吸附薄層色譜法所用固定相與吸附柱色譜法相同，常用硅膠和氧化鋁等吸附劑作固定相，有時(shí)根據(jù)需要也選用其它吸附劑，如聚酰胺、硅藻土、纖維素等。但吸附薄層色譜法中采用的吸附劑粒度要比吸附柱色譜法中所用的粒度更細(xì)，約為200目（10～40 mm)左右，所以吸附薄層色譜法的分離效率要比吸附柱色譜法高。

2. 流動(dòng)相

薄層色譜法中采用單一溶劑或多元混合溶劑作流動(dòng)相，稱為展開劑（developingsolvent, developer)。與吸附柱色譜法中選擇流動(dòng)相的一般規(guī)則相同，展開劑的選用要從被分離試樣組分極性、吸附劑活性和展開劑的極性三個(gè)因素綜合考慮。對(duì)于極性較小的被分離試樣組分，應(yīng)選用活性較強(qiáng)的吸附劑，極性較小的展開劑；對(duì)于極性較大的被分離試樣組分，應(yīng)選用活性較弱的吸附劑，極性較大的展開劑。Stahl 設(shè)計(jì)了一個(gè)示意圖來表示被分離試樣組分極性、吸附劑活性和展開劑極性這三者之間的關(guān)系（見圖8－4)。使用這個(gè)簡圖時(shí)，首先根據(jù)被分離試樣組分極性，將三角形的一個(gè)角固定在相應(yīng)的位置，這時(shí)，三角形的另兩個(gè)角就指明了相應(yīng)的吸附劑活性和展開劑極性。

圖8－4  被分離試樣組分極性、吸附劑活性和展開劑極性之間關(guān)系示意圖

在展開時(shí)，通常先根據(jù)試樣組分的極性，用單一溶劑展開，其優(yōu)點(diǎn)是溶劑簡單，分離重現(xiàn)性好。但對(duì)于難分離化合物，常常需要采用多元混合展開劑來調(diào)整展開劑的極性，以達(dá)到滿意的分離效果。多元混合展開劑中的各種溶劑在展開過程中所起作用不同。占比例較大的溶劑為主要溶劑，可使試樣組分溶解并基本分離；占比例較小的溶劑可進(jìn)一步調(diào)整各組分R_f值，改善分離效果。例如，某試樣用甲苯作展開劑進(jìn)行展開時(shí)，如果R_f值太小，斑點(diǎn)在原點(diǎn)附近，則可加入一定量的極性相對(duì)較大的溶劑，如丙酮或乙醇等；反之，如果R_f值太大，斑點(diǎn)在溶劑前沿附近，則可加入一定量的極性相對(duì)較小的溶劑，如環(huán)己烷或石油醚等，并根據(jù)分離的效果調(diào)整多元混合展開劑中各溶劑的比例。此外，在分離酸性或堿性組分時(shí)，往往還在展開劑中加入少量酸或堿，以防這些組分離解，使這些組分的斑點(diǎn)更加集中和清晰，從而提高分離度。當(dāng)展開劑的粘度太大時(shí)，可在展開劑中加入粘度小的溶劑，以降低展開劑粘度，從而提高展開速度。

（三)操作技術(shù)

1. 薄層板的類型、制備和活化

（1)類型：薄層板可分為不加粘合劑的軟板和加粘合劑的硬板兩種類型。軟板無商品，須自制。硬板有商品，也可以自制。其尺寸可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和層析缸的大小自由選擇。常用的粘合劑有煅石膏(Gypsum，簡稱G)、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na)、淀粉和聚丙烯酸（為高效薄層板常用粘合劑)。依據(jù)吸附劑是否含粘合劑或熒光劑，薄層色譜法用的硅膠有硅膠G（含煅石膏作粘合劑)、硅膠H（不含粘合劑)，以及硅膠HF₂₅₄、硅膠GF₂₅₄等品種（F代表吸附劑中含熒光劑，在254 nm或366nm紫外光下可觀察到熒光，所制備的薄層板適用于本身不發(fā)熒光且不易顯色的試樣)。氧化鋁也因其是否含粘合劑或熒光劑而分為氧化鋁G，氧化鋁GF₂₅₄及氧化鋁HF₂₅₄等品種。

（2)制備：軟板的制備很簡單，只要將吸附劑直接平鋪在光潔的玻璃或塑料板上即可。但軟板的分離效率差，并且很容易松動(dòng)損壞，所以應(yīng)用不多。薄層色譜法通常采用硬板。硬板的制備方法是在含粘合劑的吸附劑內(nèi)加入一定比例的水，調(diào)成糊狀后鋪層。鋪層的方法有傾注法，刮層平鋪法和涂鋪器鋪層法，要求制成的板均勻光滑、厚度一致（0.25～1mm)。

（3)活化：把涂好的薄層板放在水平的臺(tái)面上，在室溫下自然涼干，然后放入烘箱加熱一定時(shí)間，使吸附劑活化（通常，硅膠板在105～110℃活化30 min)�；罨�后的薄層板放入干燥器備用。

2. 點(diǎn)樣  點(diǎn)樣前，通常將試樣用低沸點(diǎn)的溶劑或與展開劑極性相似的溶劑溶解，配成約1%的試樣溶液，應(yīng)避免用強(qiáng)極性的水或甲醇等溶劑溶解試樣，以防樣點(diǎn)擴(kuò)散。點(diǎn)樣時(shí)，用毛細(xì)管或微量注射器吸取試樣溶液，然后輕輕與薄層接觸，將樣液滴加到薄層板上。點(diǎn)樣量要適中，點(diǎn)樣量過大會(huì)造成斑點(diǎn)拖尾，過小則試樣組分難以檢出。一般將樣點(diǎn)點(diǎn)在離薄層板底端約2 cm處的起始線上，樣點(diǎn)越小越好，一般直徑不超過2～3 mm，點(diǎn)間距離2 cm左右。

3. 展開  樣點(diǎn)上的溶劑揮干后，即可進(jìn)行展開。常用上行展開法，即先將展開劑放在展開缸內(nèi)，然后將薄層板的點(diǎn)樣端朝下，浸入展開劑，但注意不得將樣點(diǎn)浸入展開劑中。對(duì)于軟板，薄層板應(yīng)近水平方向放置（與水平約成5°～10°角)，對(duì)于硬板，薄層板應(yīng)近垂直方向放置（薄層板與水平成45°～60°角或垂直)，然后迅速蓋上缸蓋，進(jìn)行展開（見圖8－5)。對(duì)于R_f值小的物質(zhì)，也可用下行展開法，即在薄層板上方放置一溶劑槽，將薄層板的點(diǎn)樣端朝上，靠近溶劑槽，另一端朝下，豎放在層析缸中，用濾紙或紗巾把溶劑引到板的點(diǎn)樣端，借助重力和毛細(xì)作用力使展開劑下移。此法展開劑的移行速度較快，展開距離較大，但是此法比較麻煩，分離效果也不夠好，所以實(shí)際應(yīng)用不多。

圖8-5 上行展開法示意圖

對(duì)于成分復(fù)雜的混合物，如果一次展開不能完全分離時(shí)，可采用二次展開或雙向展開。二次展開是在第一次展開后，待溶劑揮干，再用相同溶劑或不同溶劑再展開一次。雙向展開所用薄層板為近正方形，將試樣點(diǎn)在薄層板的一角，先用一種展開劑沿薄層板的一個(gè)方向展開后，取出薄層板，揮干溶劑，再選用另一種溶劑，在與第一次的展開方向相垂直的方向上作第二次展開。雙向展開方法分離效果較好，因?yàn)檫@種展開方法將在第一次展開過程中未能分離的試樣組分的斑點(diǎn)作為進(jìn)行第二次展開時(shí)的原點(diǎn)，換個(gè)方向重新展開，從而使在第一次展開過程中未能分離的試樣組分得到分離。

當(dāng)用混合溶劑作展開劑進(jìn)行展開時(shí)，要防止產(chǎn)生 “邊緣效應(yīng)”（edge effect)的不利影響。所謂“邊緣效應(yīng)”是指同一組分的斑點(diǎn)在薄層中部比在邊緣移動(dòng)慢的現(xiàn)象。即同一組分的R_f值在薄層中部小于邊緣兩側(cè)。有人認(rèn)為產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是由于層析缸內(nèi)未被混合溶劑的蒸汽飽和，所以薄層板上的混合溶劑（展開劑)不斷蒸發(fā)，蒸發(fā)的速度從薄層中央到兩側(cè)邊緣逐漸增加，由于極性較弱而沸點(diǎn)較低的溶劑較易揮發(fā)，使薄層邊緣的展開劑組成與薄層中部不同，邊緣處含更多極性較大的溶劑，洗脫能力強(qiáng)，致使靠邊緣處的組分遷移速度快。因此，在展開過程中，通常要在層析缸的內(nèi)壁襯上浸濕了展開劑的濾紙，以加速溶劑蒸發(fā)，使層析缸內(nèi)的混合溶劑蒸汽達(dá)到飽和，以消除邊緣效應(yīng)。

4. 顯色  展開后的斑點(diǎn)如果有顏色，可直接觀察和確定斑點(diǎn)在薄層板上的位置以及顏色深淺，如果沒有顏色，則須用顯色方法來確定斑點(diǎn)。常用方法有：

（1)紫外光照射法：在紫外光（一般用253.7 nm波長的汞弧燈)照射下，觀察薄層板，如果試樣能產(chǎn)生熒光，可觀察到熒光斑點(diǎn)；如果試樣不產(chǎn)生熒光而吸附劑中含熒光物質(zhì)（如硅膠GF₂₅₄)，則薄層板呈現(xiàn)熒光，斑點(diǎn)為暗色。

（2)氣熏顯色法：對(duì)于有些不飽和有機(jī)化合物，可將碘或溴置于密閉容器中，待容器中的碘或溴蒸氣飽和后，將展開后的干燥薄層板放入，碘或溴可與化合物可逆地結(jié)合，使斑點(diǎn)顯淡棕色或黃褐色。顯色后可將薄層板取出，立即標(biāo)記斑點(diǎn)。

（3)噴灑顯色劑法：在薄層板上的展開劑揮干后，用噴霧器將顯色劑溶液均勻地噴灑在薄層板上，使斑點(diǎn)顯現(xiàn)出來。可選用的顯色劑種類很多，可根據(jù)被測(cè)物質(zhì)，從色譜文獻(xiàn)或分析化學(xué)手冊(cè)中查閱選用。

（四)薄層色譜法的定性分析和定量分析

1. 定性分析 薄層色譜法的定性依據(jù)是組分的R_f值。薄層經(jīng)顯色確定斑點(diǎn)位置后，計(jì)算R_f值，然后根據(jù)試樣與純品的R_f值對(duì)照定性。由于R_f值受很多因素影響，文獻(xiàn)R_f值測(cè)定的條件在實(shí)際操作中難以完全一致，因此，文獻(xiàn)查得的R_f值只能作定性參考。實(shí)際工作中，是將試樣與純品在同一薄層板上、以完全相同的操作條件進(jìn)行分離和測(cè)定，根據(jù)二者測(cè)得的R_f值對(duì)照確認(rèn)。也可采用相對(duì)比移值R_st作定性確認(rèn)。

2.定量分析 薄層色譜的定量方法有：

（1)目視比較法：在同一薄層板上比較試樣組分斑點(diǎn)和已知含量的標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)的大小及顏色深淺，估計(jì)試樣組分的大致含量。此法屬半定量方法。

（2)洗脫法：將斑點(diǎn)位置的吸附劑全部刮下，用適當(dāng)?shù)娜軇�將吸附劑中的試樣組分洗脫下來，然后再用分光光度法或其它分析方法定量測(cè)定。此法要求溶劑對(duì)試樣組分的洗脫率較高，洗脫完全，其定量準(zhǔn)確性比目視比較法高，但操作比較麻煩。

（3)薄層掃描法：薄層掃描法（quantitation by TLC scanning)是應(yīng)用專用的薄層掃描儀直接在薄層上測(cè)量斑點(diǎn)的顏色深淺和大小，從而進(jìn)行定量的方法。薄層掃描法以一定波長和強(qiáng)度的光束照射薄層上的斑點(diǎn)，并用儀器測(cè)量照射前后光束強(qiáng)度的變化。由于光束強(qiáng)度的變化與薄層上斑點(diǎn)的顏色深淺、大小有關(guān)，所以薄層掃描法能精確地求得物質(zhì)的含量。此法測(cè)量的靈敏度和準(zhǔn)確性都很高。但需要購置價(jià)格比較昂貴的儀器。薄層掃描儀的類型和型號(hào)較多，目前應(yīng)用較多、效果較好的是雙波長雙光束薄層掃描儀。它與雙波長分光光度計(jì)的原理相同，結(jié)構(gòu)相似。此外，此法對(duì)薄層板的質(zhì)量要求也比較高。

（五)高效薄層色譜法

高效薄層色譜法（high performance thin layer chromatography，HPTLC)是在經(jīng)典薄層色譜法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。HPTLC采用的吸附劑顆粒（平均直徑約5 mm)要比TLC采用的吸附劑顆粒（平均直徑約20mm)更細(xì)、更均勻。HPTLC用聚丙烯酸等高聚物作粘合劑，采用噴霧法制備成均勻、致密、厚度約0.2 mm的高效薄層。這種薄層的展開距離短（約為3～6 cm)，展開時(shí)間也相應(yīng)較少（約3～20 min)。HPTLC的點(diǎn)樣、展開、顯色以及定量的各個(gè)步驟都是采用機(jī)械或儀器進(jìn)行的。采用自動(dòng)點(diǎn)樣器點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量比TLC少，樣點(diǎn)也更�。徊捎贸绦蚧�多次展開（programmedmultiple development)，可按預(yù)定程序作自動(dòng)多次展開，在各次展開后都用紅外線自動(dòng)烘干薄層，并可按預(yù)定程序改變展開劑的溶劑混合比例；展開后采用自動(dòng)噴霧器顯色，并用薄層掃描儀作定量測(cè)定。HPTLC比TLC的分離效率高、分離速度快、斑點(diǎn)集中、檢出限低（可達(dá)ng～pg級(jí))、分離容量大（一次實(shí)驗(yàn)最多可將40多種組分完全分離)，其操作條件的選擇也較靈活，因此，HPTLC是薄層色譜法的發(fā)展方向，是分離復(fù)雜物質(zhì)的有效方法之一。

（六)薄層色譜法的特點(diǎn)和應(yīng)用

薄層色譜法的主要特點(diǎn)是可以在一塊薄層板上同時(shí)分離和測(cè)定一批試樣和標(biāo)準(zhǔn)品，而柱色譜法只可以逐個(gè)地單獨(dú)分離測(cè)定各個(gè)試樣，所以，薄層色譜法的使用效率比柱色譜法高。而且，對(duì)于難分離的試樣，薄層色譜法可采用雙向展開法進(jìn)行分離，分離效果較好。此外，薄層色譜法還具有樣品用量少、分析速度快、所用的設(shè)備和方法簡單等優(yōu)點(diǎn)，所以應(yīng)用范圍非常廣泛。薄層色譜法在藥物檢驗(yàn)、法醫(yī)檢驗(yàn)、臨床檢驗(yàn)以及衛(wèi)生檢驗(yàn)等許多領(lǐng)域被列為一些物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)分析方法，例如，在衛(wèi)生檢驗(yàn)領(lǐng)域，薄層色譜法用于食品中營養(yǎng)成分及有害物質(zhì)黃曲霉毒素、殘留農(nóng)藥等的分析測(cè)定；在藥物檢驗(yàn)領(lǐng)域，薄層色譜法用于中國藥典中的二百多種藥品的分析測(cè)定。此外，由于薄層板是一次性使用的，所以可在一些苛刻的、損壞性的分離測(cè)定條件下使用，適于作其他色譜方法的預(yù)試驗(yàn)。

二、紙色譜法簡介

20世紀(jì)40年代起，紙色譜法就在生物化學(xué)和分析化學(xué)領(lǐng)域開始被普遍使用。由于紙色譜法設(shè)備簡單、操作方便、需要樣品量少，所以常用于初步的定性和半定量分析，也可為其它色譜分離摸索方法條件。

（一)方法原理

紙色譜法是以濾紙作載體的平面色譜法。濾紙有較強(qiáng)的吸水性，通常濾紙可含20％～25％的水分，其中6%～7%的水是以氫鍵作用的方式與紙纖維上的羥基結(jié)合在一起的，在一般情況下很難脫去，所以，紙色譜法的固定相通常就是濾紙纖維上吸附的水。在分離一些極性較小的物質(zhì)時(shí)，為了增加這些物質(zhì)在固定相中的溶解度，也可以使濾紙吸附甲酰胺、丙二醇等極性有機(jī)溶劑作為固定相。紙色譜法的流動(dòng)相（展開劑)是與水等極性溶劑不相混溶的有機(jī)溶劑，通過濾紙纖維間的毛細(xì)管作用，流動(dòng)相在濾紙上攜帶試樣組分向前移行，由于不同組分在兩相間的分配系數(shù)不同，因而產(chǎn)生差速遷移，達(dá)到彼此分離。所以紙色譜法的分離原理主要屬于正相分配色譜法。由于濾紙纖維也可能對(duì)試樣組分有吸附或離子交換作用，所以，紙色譜法的分離原理除了上述主要的分配作用外，也可能有其它的一些作用。紙色譜法的分離過程與薄層色譜法基本相似。

（二)紙色譜法的操作步驟

紙色譜法以濾紙作為固定相的載體，除了濾紙的選擇，紙色譜法的操作步驟與薄層色譜法相似。紙色譜法的主要操作步驟如下：

1. 濾紙的選擇  對(duì)濾紙的基本要求是：雜質(zhì)含量低，無明顯熒光斑點(diǎn)，以保證不影響對(duì)分離結(jié)果的觀察；質(zhì)地均勻，平整無折痕，邊緣整齊，以保證展開時(shí)展開劑能勻速向前移行；紙纖維松緊適當(dāng)，以保證展開劑以適宜的速度向前移行；有一定的機(jī)械強(qiáng)度，以保證濾紙?jiān)诒徽归_劑潤濕后仍能維持原狀。濾紙有不同的型號(hào)，根據(jù)其厚度可分為厚型濾紙和薄型濾紙，根據(jù)其紙纖維松緊程度可分為快速、中速和慢速濾紙。厚型濾紙載樣量大，適宜作定量或制備用；薄型濾紙則適宜作定性用。此外，應(yīng)根據(jù)分離對(duì)象和展開劑性質(zhì)選擇不同型號(hào)的濾紙。對(duì)于R_f值相差較小的混合物，宜選用慢速濾紙；而對(duì)于R_f值相差較大的組分，宜選用快速或中速濾紙。當(dāng)采用正丁醇等粘度較大的展開劑時(shí)，宜選用紙纖維疏松的快速濾紙；當(dāng)采用石油醚、三氯甲烷等粘度較小的展開劑時(shí)，宜選用紙纖維緊密的慢速濾紙。

2. 點(diǎn)樣、展開與顯色  紙色譜法的點(diǎn)樣方法基本上與薄層色譜法相同。點(diǎn)樣后，將濾紙懸掛在盛有展開劑的層析缸內(nèi)展開（見圖8－6)。紙色譜常用的展開劑有正丁醇、正戊醇、苯甲酸和酚等有機(jī)溶劑。展開劑使用前，要預(yù)先使展開劑中溶解的水達(dá)到飽和，否則在展開過程中會(huì)把固定相的水分奪走，影響分配過程的進(jìn)行。在分離某些易分解的弱酸性或弱堿性試樣組分時(shí)，可在展開劑中加入適量的弱酸或弱堿（如乙酸，氨水和吡啶等)，以防止這些組分解離。有時(shí)為了加大展開劑的極性，使其對(duì)極性化合物的展開能力增強(qiáng)，可在展開劑中加入一定比例的甲醇、乙醇。紙色譜法的顯色也與薄層色譜法相似，但不能用腐蝕性顯色劑，也不能在高溫下顯色。

圖8-6  紙色譜法展開示意圖

3. 紙色譜法的定性分析和定量分析 與薄層色譜法相似，紙色譜法定性的依據(jù)也是R_f值。紙色譜法的定量通常為半定量方法，一般采用目視比較法或剪紙洗脫法進(jìn)行定量測(cè)定。

  （金念祖)