各論微生物的分離與鑒定
一病原性球菌的檢查
Examination of Pathogenic Cocci
【實驗目的】
1掌握病原性球菌的菌落、菌體形態(tài)特征及染色性。
2熟悉病原性球菌的分離培養(yǎng)與鑒定方法。
【實驗原理】
引起化膿性炎癥的球菌，主要有葡萄球菌、鏈球菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎球菌和淋球菌。識
別化膿性球菌，主要根據(jù)形態(tài)、染色性、培養(yǎng)特征及生化反應。除鏈球菌、肺炎鏈球菌及腦
膜炎球菌必須做血清學分型外，一般無需做抗原分析和動物試驗。血清學分型的主要目的是
為了追蹤傳染源，以便加以控制，因此，普通實驗室用之不多。
【實驗內(nèi)容和方法】
一病原性球菌的菌落特征觀察
1葡萄球菌(Staphylococcus)：在血瓊脂平板上培養(yǎng)18～24小時，形成圓形凸起，表面光
滑；濕潤，表面整齊，不透明的菌落。金黃色葡萄球菌金黃色，可產(chǎn)生透明溶血環(huán)；表皮葡
萄球菌白色，無溶血環(huán)；腐生葡萄球菌白色或檸檬色，無溶血環(huán)。
2鏈球菌(Streptococcus)：在血瓊脂平板上培養(yǎng)18～24小時，形成圓形凸起，半透明或不
透明，灰白色的菌落。甲型鏈球菌不完全溶血，在菌落周圍形成草綠色溶血環(huán)；乙型鏈球菌
完全溶血，形成透明溶血環(huán)；丙型鏈球菌不發(fā)生溶血，無溶血環(huán)。
3肺炎鏈球菌(Diplococcus Pneumoniae)：在血瓊脂平板上培養(yǎng)18～24小時，形成細小、
扁平、半透明、灰白色的菌落，菌落周圍有草綠色溶血環(huán)，與甲型鏈球菌相似，培養(yǎng)2～3天
后，因菌體發(fā)生自溶，菌體中央下陷呈“臍狀”。
4腦膜炎球菌(N.Meningitidis)：在巧克力瓊脂平板上加5%CO237℃培養(yǎng)24小時，形成圓
形、光滑、凸起透明似露球的菌落。在血瓊脂平板上不發(fā)生溶血。
5淋球菌(N.gonococcus)：菌落特征與腦膜炎球菌相同。
二病原性球菌的菌體形態(tài)及染色性觀察
細菌種類〖〗菌體形態(tài)
〖〗染色性
葡萄球菌〖〗排列不規(guī)則，常呈葡萄串狀，有時呈鏈狀或散在〖〗G+
鏈球菌〖〗長短不一的鏈狀排列〖〗G+
肺炎鏈球菌〖〗矛尖狀雙球菌〖〗G+
腦膜炎球菌〖〗腎形或豆形成雙排列〖〗G-
淋球菌〖〗咖啡豆形成雙排列〖〗G-
三標本采集
病原性球菌常引起化膿性疾病，分離用標本多采用膿液、痰液，也可從分泌物、血液及穿刺
中取材。(1)膿汁：用無菌棉拭挑取患部深處膿液或分泌物，放入無菌試管內(nèi)；(2)痰液：用
消毒過的容器收集病人痰液，以無菌棉拭挑取濃稠痰塊，放入無菌試管內(nèi)；(3)咽部分泌物
：囑病人張開口，用壓舌板壓舌根部，用無菌棉拭從鼻咽部擦拭取材，放入無菌試管內(nèi)；(4
)腦脊液：對疑患流腦的患者作腰椎穿刺取腦脊液，放入無菌試管內(nèi)，立即送檢；(5)尿道、
陰道分泌物：對淋病可疑患者，男性可從尿道內(nèi)1—2厘米處取材，女性可從宮頸口取分泌物
，立即送檢。
四病原性球菌的分離與鑒定
待檢標本可直接作涂片染色檢查鑒定，必要時可作分離培養(yǎng)及生化反應鑒定。常見病原性球
菌的檢查程序如下：
膿汁、痰、咽部分泌物直接涂片、革蘭氏染色、鏡檢
血瓊脂平板培養(yǎng)觀察菌落性狀、溶血性、色素
挑取可疑菌落涂片染色鏡檢純培養(yǎng)生化反應動物實驗
藥敏實驗
血液、穿刺液—→肉湯增菌培養(yǎng)—→培養(yǎng)液涂片染色境檢
二腸道致病菌的檢查
Examination of Enteric Pathogens
【實驗目的】
了解腸道桿菌的生物學特征、分離與鑒定方法。
【實驗內(nèi)容和方法】
一腸道桿菌形態(tài)學觀察
腸道桿菌是人和動物腸道中的細菌，多數(shù)為非致病菌或條件致病菌，少數(shù)為致病菌。腸道病
原菌主要是指沙門氏菌屬、痢疾桿菌屬、霍亂弧菌三大重要致病菌。此外，某些致病性大
腸桿菌也可引起腸道感染。腸道桿菌都是革蘭氏陰性菌，形態(tài)、排列相似，但生化反應、抗
原結(jié)構(gòu)有差異，因此常用生化反應和血清學試驗進行鑒定。
二腸道桿菌的分離培養(yǎng)與鑒定
腸道病原菌與常居正常菌群形態(tài)相似，大多為革蘭氏陰性桿菌。因此，對腸道致病菌的檢驗
，首先必須與常居菌區(qū)分開。腸道非致病菌大多數(shù)能分解乳糖產(chǎn)生酸，使指示劑變色，菌
落呈變色反應，而致病菌一般不分解乳糖，不產(chǎn)酸，菌落不變色。
1、首先可將標本接種于腸道菌鑒別培養(yǎng)基——SS瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，37℃24小時后觀察菌
落特征。致病菌菌落為無色，非致病菌為粉紅色，從而把大部分非致病菌與致病菌分開。
2、挑取可疑致病菌單個菌落，以穿刺劃線法接種于半固體雙糖鐵培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)2
4小時觀察結(jié)果，即通過生化反應初步辨別出菌屬或菌種。
3、最后通過特異性的血清學試驗來鑒定菌種、菌型或亞型。必要時進行系統(tǒng)生化鑒定。
鑒定程序為：
糞便—→SS瓊脂培養(yǎng)—→挑取可疑菌落
血骨髓
—→增菌培養(yǎng)雙糖鐵培養(yǎng)基血清學鑒定染色鏡檢
生化反應
附：SS瓊脂培養(yǎng)基：
①用途：用于分離培養(yǎng)沙門氏菌及志賀氏菌。
②成分：
蛋白胨5g枸櫞酸鐵1g
乳糖10g牛肉膏25g
膽鹽10g0.1%煌綠溶液0.33ml
枸櫞酸鈉10g1%中性紅溶液2.5ml
硫代硫酸鈉10g瓊脂20g
蒸餾水1000ml調(diào)pH7.0
③原理：中性紅在培養(yǎng)基中起指示劑作用，大腸桿菌能分解乳糖產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基pH下降，故
菌落呈紅色；一般腸道致病菌不分解乳糖，但分解蛋白胨產(chǎn)生堿性物質(zhì)，所以菌落呈淡黃色
。膽鹽、枸櫞酸鈉對一般革蘭氏陽性菌及大多數(shù)大腸桿菌有抑制作用，而對腸道病原性桿菌
無抑制作用或作用較弱，并且膽鹽有促進沙門氏菌、痢疾桿菌生長的作用。
雙糖鐵培養(yǎng)基：
①用途：初步鑒別腸道革蘭氏陰性桿菌對糖類的發(fā)酵作用，觀察細菌有無硫化氫產(chǎn)生，觀察
細菌有無動力。
②成分：含酚紅指示劑［pH8.7(紅色)～pH6.8(黃色)］的pH7.6的蛋白胨水。
硫酸亞鐵氨0.02%瓊脂0.35%
乳糖1%
瓊脂1.3%
③原理：上層中的乳糖用以鑒別腸道桿菌，致病菌不發(fā)酵乳糖，而大腸桿菌則能發(fā)酵乳糖，
產(chǎn)酸而使上層斜面變成黃色。硫酸亞鐵氨用以檢查細菌分解蛋白質(zhì)后是否產(chǎn)生硫化氫，如
有硫化氫產(chǎn)生則與培養(yǎng)基中的硫酸亞鐵起化合作用而成黑色的硫化鐵。硫代硫酸鈉能起還原
作用，以防止硫化氫被氧化而影響結(jié)果。下層為半固體，可觀察腸道桿菌的動力；觀察細菌
對葡萄糖分解產(chǎn)酸、產(chǎn)氣情況。
【注意事項】
●腸道傳染病患者的診斷檢驗，常是采取糞便標本進行分離培養(yǎng)。但沙門氏菌感染，特別是
腸熱癥患者，應根據(jù)不同病期采取血、尿或骨髓進行細菌培養(yǎng)。血清做肥達氏試驗(見綜合
性實驗一·七)，以提高檢驗的陽性率。
●腸道病原菌的抵抗力比常居菌弱，若糞便標本不及時送檢而放置過久，則由于大腸桿菌等
旺盛增殖，易使病原菌消失或死亡，其中尤以痢疾桿菌最為敏感。為提高痢疾桿菌的培養(yǎng)陽
性率，最好在患者床邊取新鮮糞便標本，及時接種于合適的payment-defi.com培養(yǎng)基上。如不能立即培養(yǎng)，
應將糞便標本置于30%甘油緩沖液中保存。
大腸桿菌、傷寒桿菌和痢疾桿菌的生物學特征
菌種〖〗形態(tài)、排列及染色性〖〗在SS平板上的菌落特征〖〗含鐵雙糖培養(yǎng)基乳糖〖〗葡萄
糖〖〗硫化氫〖〗動力
大腸桿菌〖〗桿狀，散在排列〖〗菌落較大，不透明呈紅色〖〗+〖〗+〖〗-〖〗+
傷寒桿菌〖〗同上〖〗菌落較小，半透明無色或淡黃色〖〗-〖〗+〖〗+/-〖〗+
副乙傷寒桿菌〖〗同上〖〗菌落較小，半透明無色或淡黃色〖〗-〖〗+〖〗+/-〖〗+
痢疾桿菌〖〗同上〖〗菌落小，半透明無色或淡黃色〖〗-〖〗+〖〗-〖〗-
三霍亂弧菌的檢查
Examination of V.cholerae
【實驗目的】
了解霍亂弧菌的檢驗方法。
【實驗原理】
對霍亂病人的診斷檢驗，主要靠分離鑒定病原體�；魜y弧菌的主要特點是菌體彎曲呈弧狀或
逗點狀，培養(yǎng)特點是嗜堿怕酸，往往能出現(xiàn)霍亂紅反應(即亞硝酸靛基質(zhì)反應)，抗原構(gòu)造
特異。其診斷檢驗方法與一般腸道病原菌不同，主要步驟及特點見下表：
待檢標本
(糞便或嘔吐物)
→鏡檢→涂片革蘭氏染色→陰性弧菌
→懸滴(暗視野)→動力(+)，制動(+)
→培養(yǎng)→堿性蛋白胨水37℃——68h→鏡檢(弧菌，能運動)→堿性瓊脂平板分離培養(yǎng)→霍亂紅反應(+)
→堿性瓊脂平板37℃——1024h→鏡檢(弧菌)
→玻片凝集試驗(+)
【實驗內(nèi)容與方法】
1鏡檢：注意其形態(tài)和染色特性。
2觀察培養(yǎng)物：該菌在堿性蛋白胨水培養(yǎng)基中呈均勻混濁，有時
在液體表面生成薄菌膜。
3動力檢查和制動試驗：霍亂弧菌一端有一根鞭毛，在液體中可
活潑運動，若在上述呈活
潑運動的細菌懸滴中加一滴抗該菌的免疫血清，由于鞭毛與抗體特異結(jié)合，可使細菌停止運
動，此為制動試驗陽性。
①動力檢查：用接種環(huán)沾取霍亂弧菌液體培養(yǎng)物一滴，加于玻片中央，置高倍顯微鏡下觀察
，注意是否有穿梭狀活潑運動。
②制動試驗：以接種環(huán)沾取霍亂菌液一滴，放于璃片中央，同時加一接種環(huán)抗霍亂弧菌多價
免疫血清，混勻后，在高倍鏡下觀察，細菌運動是否被抑制。
四白 喉 桿 菌 的 檢 查
Examination of C.diphtheriae
【實驗目的】
掌握白喉桿菌的一般特征，了解白喉桿菌的毒性。
【實驗原理】
白喉桿菌屬于棒狀桿菌屬，為革蘭氏陽性的細長桿菌，常會出現(xiàn)多形態(tài)，排列不規(guī)則，有時
呈柵欄狀，沒有鞭毛、芽胞和莢膜。染色時菌體著色不均勻，菌體一端或兩端染色與菌體不
同，稱為異染顆粒。
對白喉桿菌的檢查，主要是根據(jù)細菌形態(tài)，特別是極體的異染特點，此外還可根據(jù)生化反應
及毒力試驗等進行鑒定。
分離培養(yǎng)白喉桿菌時，常用呂氏凝固血清斜面及亞碲酸鉀血平板。在這兩種培養(yǎng)基上，白喉
桿菌生長較其它菌快，形態(tài)典型。亞碲酸鉀被吸入菌體內(nèi)使菌落呈黑色。
【實驗內(nèi)容與方法】
一形態(tài)觀察
觀察白喉桿菌革蘭氏染色和異染顆粒染色標本。
二白喉桿菌培養(yǎng)特征觀察
觀察白喉桿菌在呂氏血清斜面和亞碲酸鉀血平板上的菌落特點。
三家兔皮內(nèi)試驗法
家兔上皮細胞受白喉桿菌毒素作用后，蛋白質(zhì)合成受阻，從而表現(xiàn)紅腫、壞死，其毒性作用
可被相應抗毒素中和而不出現(xiàn)毒性作用。
【材料】
白喉桿菌白毛家兔白喉抗毒素注射器
【方法】
1用5毫升鹽水洗下白喉桿菌呂氏血清斜面24小時培養(yǎng)物，制成菌懸液。
2將家兔背部兩側(cè)的毛剪去，局部皮膚消毒后，在背的一側(cè)皮內(nèi)注射上述菌懸液0.1毫升。
3經(jīng)4～6小時后，從家兔耳靜脈注入白喉抗毒素1000單位，再將留下的菌懸液在背部另側(cè)
皮內(nèi)注射0.1毫升作為對照。
【結(jié)果分析】
注射后24、48、72小時觀察結(jié)果。如試驗一側(cè)的注射部位發(fā)生紅腫及壞死現(xiàn)象而對照的一側(cè)
無此現(xiàn)象者，即為陽性(有毒力)。
四平板毒力試驗法
毒素與抗毒素在瓊脂內(nèi)擴散相遇，當其比例適合時便形成肉眼可見的特異性沉淀線，本實驗
代替動物皮內(nèi)實驗，其優(yōu)點是簡便，不需要動物。且多認為與動物試驗結(jié)果相一致。
【材料】
蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基無菌馬(或兔)血清白喉抗毒素待檢菌培養(yǎng)物無菌平皿
【方法】
1制備平板：取胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基10毫升(其中含麥芽糖及乳糖)，加熱溶解，冷卻至50
℃左右，加入滅活的無菌馬(或兔)血清2毫升，混勻(勿出氣泡)，立即傾注平皿內(nèi)制成血清
瓊脂平板培養(yǎng)基。
2加抗毒素：當平皿內(nèi)瓊脂尚未完全凝固前，取浸有白喉毒素(500單位/毫升)的無菌紙條(
60×15mm)放于平板中央。待瓊脂凝固后，平板放于37℃孵箱內(nèi)烘1-2小時(為防止污染，平
板向下)，使培養(yǎng)基表面干燥。
3接種細菌：將待檢的白喉桿菌在與濾紙片呈垂直方向劃線接種于平板面上，接種量宜多
些，同時
另用能產(chǎn)生毒素和不能產(chǎn)生毒素的白喉桿菌按上法劃線接種于其兩側(cè)(呈平行線)，作為陽性
及陰性對照。
4培養(yǎng)：將接種物放于37℃培養(yǎng)24-72小時后觀察結(jié)果。
【結(jié)果分析】
在抗毒素紙條與被檢細菌劃線的交角處有白色沉淀線者，即是該菌產(chǎn)生的毒素與抗毒素在瓊
脂中彌散相遇呈最適比例而出現(xiàn)沉淀線，證明此菌是為產(chǎn)毒株。若不出現(xiàn)沉淀線，則為不產(chǎn)
毒株。陽性對照應出現(xiàn)沉淀線，陰性對照不應有沉淀線。
附：
一呂氏血清斜面培養(yǎng)基
1.成分：1%葡萄糖肉湯(pH7.4)1份，動物血清3份。
2.制法：將上述成份混合，并分裝于無菌試管中，每管5毫升；然后斜置于血清凝固器中
，間歇滅菌，第一天75℃經(jīng)1小時，第二天80℃經(jīng)半個小時，第三天85℃經(jīng)半小時；將培養(yǎng)
基于37℃孵育24小時，若無雜菌生長，可供使用。
二亞碲酸鉀血平板
1.成份：肉浸液瓊脂(pH7.4～7.6)100毫升，1%亞碲酸鉀水溶液2毫升，0.5%胱氨酸水溶液
2.制法：加熱溶化已滅菌的肉浸液瓊脂，待冷至50℃左右，加入滅菌的亞碲酸鉀溶液、胱
氨酸溶液及無菌脫纖維血，混勻，傾注平皿。凝固，冷藏備用。
3.說明：
(1)白喉桿菌能使亞碲酸鉀還原為碲，故菌落呈黑色。亞碲酸鉀可抑制標本中革蘭氏陰性球
菌生長，有利于白喉桿菌的檢出。
(2)胱氨酸和血液都是促進白喉桿菌生長的營養(yǎng)物。
(3)胱氨酸及亞碲酸鉀均不耐高溫，應用間歇滅菌或濾菌器過濾除菌。
Examination of Cl.tetani and Cl.perfringens
【實驗目的】
1熟悉破傷風桿菌及產(chǎn)氣莢膜桿菌的形態(tài)及培養(yǎng)特征。
2熟悉破傷風桿菌及產(chǎn)氣莢膜桿菌使動物發(fā)病時的癥狀。
【實驗原理】
厭氧芽胞桿菌屬又稱梭狀芽胞桿菌屬，為革蘭氏陽性桿菌。能形成芽胞，多數(shù)有鞭毛，營養(yǎng)
要求不高，但需要嚴格厭氧環(huán)境。常見的致病菌有破傷風桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌和肉毒桿菌等
。
鑒定這類細菌，主要是根據(jù)細菌形態(tài)、培養(yǎng)特征及生化反應，必要時還需做動物實驗檢查菌
株的產(chǎn)毒能力。
破傷風桿菌是破傷風的病原體，常由于外傷后創(chuàng)口被泥土或糞便污染而受傳染。本菌芽胞為
圓形，位于菌體頂端，呈鼓槌狀，周身有鞭毛，在血平板上能溶血，菌落邊緣不整齊，易
向外擴散呈羽毛狀。不發(fā)酵牛乳。
氣性壞疽可由多種病原菌引起，尤以產(chǎn)氣莢膜桿菌最為常見。產(chǎn)氣莢膜桿菌無鞭毛，不能運
動；在一定環(huán)境中形成莢膜，芽胞位于菌體中央或偏端：血平板上形成圓形濕潤菌落， 明
顯溶血，能分解糖類，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，在牛乳培養(yǎng)基中產(chǎn)生“洶涌發(fā)酵”現(xiàn)象。
【實驗內(nèi)容和方法】
一形態(tài)及染色鏡檢
注意菌體形態(tài)、染色特性，對比兩菌的芽胞形態(tài)、大小及在菌體中的位置。
二培養(yǎng)及生化特性的檢驗
觀察下列培養(yǎng)物的特征：
1肉渣湯培養(yǎng)物：觀察肉渣湯是否渾濁，肉渣色澤是否變化，是否產(chǎn)生氣體。
2血瓊脂平板培養(yǎng)物：觀察菌落特點，有無溶血環(huán)。
3牛乳培養(yǎng)物：是否發(fā)酵牛乳及使酪蛋白凝固，有無產(chǎn)生氣體出現(xiàn)“洶涌發(fā)酵”現(xiàn)象。
4高層葡萄糖瓊脂培養(yǎng)物：有無產(chǎn)生氣體使瓊脂斷裂。
三破傷風毒素實驗(見綜合性實驗一第九部分)
四產(chǎn)氣莢膜桿菌動物體內(nèi)產(chǎn)氣實驗
1用滅菌注射器抽取產(chǎn)氣莢膜桿菌肉渣培養(yǎng)物0.2～1.0毫升，注入小白鼠腹腔內(nèi)。
25分鐘后殺死動物，送入37℃溫箱中放置5～8小時。
3觀察動物腹部，如有膨脹氣腫現(xiàn)象，解剖檢查見有厭氧芽胞桿菌者，即大致為產(chǎn)氣莢膜
桿菌。
六結(jié)核桿菌的檢查
Examination of M.tuberculosis
【實驗目的】
1熟悉結(jié)核桿菌的菌體形態(tài)。
2掌握抗酸染色法的原理及操作過程。
【實驗原理】
結(jié)核桿菌為細長的桿菌，有分枝生長趨勢。結(jié)核桿菌菌體有一層很厚的臘質(zhì)包膜，不易被一
般染料著色，經(jīng)加溫或延長時間才能著色，一旦著色，能抵抗鹽酸酒精的脫色作用，故又稱
抗酸桿菌。分枝桿菌屬細菌為抗酸菌。
抗酸染色法的原理：石炭酸復紅在脂類中的溶解度高于鹽酸酒精，結(jié)核桿菌含有較多量的分
枝菌酸及其衍生物，易與石炭酸復紅牢固結(jié)合，所以不被鹽酸酒精脫色，而其它細菌含脂類
較少，缺乏抗酸性。此外，與結(jié)核桿菌細胞壁的完整性有關�？顾崛旧ㄊ氰b別結(jié)核桿菌的
重要方法之一，常用的是妻尼(Ziehlneelsen)氏法。
如果痰標本中含的結(jié)核桿菌少(含量在105個/ml以下)，直接涂片法常不易檢出，可用濃縮
集菌
法，即將痰液用4%NaOH或3%HCl處理，溶解標本中的粘綢性有機物，使痰液中包裹的細菌釋
放出來。然后用離心法或用汽油、二甲苯等作漂浮法集菌，使細菌濃縮集中，再涂片作抗酸
染色，易找到細菌。
【實驗內(nèi)容和方法】
一抗酸染色法
【材料】
結(jié)核桿菌(卡介苗)與變形桿菌混合菌液石炭酸復紅3%鹽酸酒精堿性美蘭
【方法】
1在載玻片上作結(jié)核桿菌、變形桿菌混合菌液涂片，自然干燥后，火焰固定。
2將石炭酸復紅染液加滿于涂膜部位，經(jīng)15分鐘后用水沖洗。
3滴加3%鹽酸酒精脫色，輕輕晃動玻片，直至無紅色流下為止，用水沖洗。
4用堿性美蘭復染1分鐘后水洗，干燥鏡檢。
【結(jié)果】結(jié)核桿菌呈紅色，變形桿菌呈藍色。
七嗜酸乳桿菌的分離與鑒定
Isolation and Identification of L.acidophilus
【實驗目的】
1熟悉嗜酸乳桿菌分離與鑒定方法。
2了解生物治療劑(微生態(tài)制劑)拮抗病原菌的作用機理。
【實驗原理】
乳酸菌是一群可發(fā)酵碳水化合物以獲取能量并能生成大量乳酸的一類細菌的總稱，嗜酸乳桿
菌是其中的一種，主要存在于人和動物腸道、口腔和陰道中�，F(xiàn)已證實，嗜酸乳桿菌能產(chǎn)生
細菌素(蛋白質(zhì)和多肽)，如乳桿菌素A(lactocin A)、乳桿菌素B(lactocin B)、乳桿菌素F(
lactocin F)、aciclocin A、aciclcin B等，具有殺死或抑制其它微生物的生長。因此，
篩選出強烈拮抗某種病原菌的嗜酸乳桿菌菌株，研制成口服活菌制劑，可用于細菌感染性疾
病的防治。
采用選擇性的LC培養(yǎng)基及微需氧培養(yǎng)方法，從新鮮糞便標本中分離嗜酸乳桿菌。利
用API20A鑒定系統(tǒng)對分離株進行鑒定，并結(jié)合細菌DNA的G+Cmol%的結(jié)果，鑒定出嗜酸乳桿菌
。
【實驗內(nèi)容和方法】
一培養(yǎng)基配制
【方法】
1稱取適量的LC培養(yǎng)基(胰蛋白胨10克、牛肉膏10克、酵母浸粉5克、葡萄糖10克、醋酸鈉1
5克、磷酸氫二鉀6克、檸檬酸銨2克、MgSO4·7H2O0.57克、MnSO4·H2O 0.12克、FeSO4
0.03克、Tween80 1克)，加入蒸餾水至1000ml，煮沸溶解。
2加入冰醋酸，調(diào)pH為5.5～6。
3100℃(8磅)高壓蒸汽滅菌15～20分鐘。
二嗜酸乳桿菌的分離與鑒定
【方法】
1取新鮮糞便標本約黃豆粒大小，加入生理鹽水2ml，混勻，制成懸液。取懸液約0.2ml，
加入裝有2ml的小試管中稀釋，混勻。
2吸取0.1ml稀釋液滴在LC平板中央，用L棒涂開。
3將平板置于厭氧罐內(nèi)，充入混合氣體(80%N2，10%H2，10%CO2)，于37℃下培養(yǎng)3天
。
4挑取可疑單個菌落轉(zhuǎn)種至斜面(需純化三次)。
5通過革蘭氏染色(+)、葡萄糖發(fā)酵實驗(同型)、厭氧和需氧試驗進行初篩，再經(jīng)API鑒定
卡鑒定，最后測定G+Cmo%。
附實驗結(jié)果分析
嗜酸乳桿菌具有以下特征：
①在選擇性LC培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)：菌落細小(直徑為0.5～2mm)，表面粗糙，園形凸起，
邊緣不整齊。
②菌體形態(tài)：菌體直或微彎，形態(tài)細長，兩端圓，成雙或短鏈，無芽胞。
③革蘭氏染色陽性。
④20種單糖生化反應(略)。
⑤G+C mol%為34～37%。
八狂犬病毒包涵體觀察
【實驗目的】
了解狂犬病毒包涵體的特征及病變細胞的特點。
【實驗原理】
病毒一般需用電子顯微鏡才能看見。電鏡下多數(shù)病毒呈球型，少數(shù)呈絲狀或磚塊狀，細菌病
毒多數(shù)呈蝌蚪狀。某些病毒在組織細胞中能形成包涵體(病毒顆粒的集聚體)。將病變材料做
切片或涂片，用麥氏或姬姆染色法染色，普通光學顯微鏡即可看到。包涵體呈圓形或卵圓形
，大小不等。根據(jù)病毒種類不同，包涵體存在部位(胞漿或胞核內(nèi))及染色性狀(嗜酸性或嗜
堿性)也不同，借此可幫助診斷。
狂犬病毒主要侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在神經(jīng)細胞中大量繁殖，取病犬腦組織海馬回部切片標本
經(jīng)染色后，置油鏡下觀察，可見狂犬病毒包涵體位于胞漿中，染成鮮紅色，呈圓形或橢圓形
。神經(jīng)細胞呈三角形，細胞核為藍色，間質(zhì)為淡紅色。
九乙型肝炎病毒HBsAg和HBeAg的檢測
【實驗目的】
熟悉ELESA法檢測乙型肝炎病毒“二對半”抗原抗體試驗原理、方法及結(jié)果分析。
【實驗原理】
酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)是用酶標記的抗體或抗抗體來檢測標本中的病毒抗原或血清抗體
。酶標抗體或抗抗體若被待檢的抗原或抗體固定在微孔反應板上，當加入的酶作用底物后則
出現(xiàn)底物被酶解后的顯色反應。該法敏感性高，特異性強，試劑安全、易保存、操作簡便。
乙型肝炎病毒目前檢測的方法主要采用(1)血清學方法檢測血清中
的乙肝“二對半”抗原和抗體；(2)PCR檢測血清中乙肝DNA。
【實驗方法】
1取已知包被抗體(抗HBs或抗HBe的單克隆抗體)，用包被液按1∶100稀釋，然后用100
ul的移液器以每孔0.1ml加于微量反應板(聚苯乙烯板)內(nèi)。
2將反應板置搪瓷方盤中，放4℃過夜，次日取出甩盡孔內(nèi)液體，用洗滌液洗3次，每次3分
鐘。
3洗滌后，每孔加入待檢0.1ml血清標本和HBsAg/HBeAg陽性、陰性對照血清，將反應板置
濕瓷盤中放37℃作用2小時，取出按上法洗滌。
4加入辣根過氧化物酶標記的抗HBs(或抗HBe)抗體0.1ml于各孔中，置37℃作用2小時
，取出洗滌。
5加新鮮配制的鄰苯二胺(OPD)底物0.1ml，放37℃作用30分鐘后加終止液每孔0.1ml。通過
顏色反應來判斷結(jié)果。
十衣原體、立克次體、支原體、螺旋體形態(tài)觀察
【實驗目的】
1觀察衣原體、立克次體、支原體、螺旋體的形態(tài)特征。
2了解暗視野顯微鏡的使用方法。
【實驗原理】
衣原體包括一類形態(tài)相似，能通過濾菌器，嚴格細胞內(nèi)寄生，其發(fā)育繁殖有獨特的生活周期
的微生物，引起沙眼的衣原體可在細胞內(nèi)形成包涵體。立克次體是一類生物學性狀介于細菌
和病毒之間的、天然寄生于一些節(jié)肢動物體內(nèi)的專性活細胞內(nèi)寄生的微生物，絕大多數(shù)在光
學顯微鏡下可見。支原體是一群介于細菌與病毒之間，能營獨立生活的最小微生物，由于它
們體積微小，且缺乏細胞壁，普通染色后光學顯微鏡下不易見到單個支原體，電鏡可見具有
典型的多形性。在無生命的人工培養(yǎng)基中能生長繁殖，形payment-defi.com/sanji/成細小菌落，用低倍鏡觀察可見“
油煎蛋狀”菌落。螺旋體是一類細長、柔軟、彎曲呈螺旋狀的單細胞微生物，
在暗視野顯微鏡下容易觀察到形態(tài)。
【實驗內(nèi)容和方法】
1沙眼包涵體觀察
沙眼病人眼結(jié)膜刮片，經(jīng)姬姆薩氏(Giemsa)染色，沙眼包涵體系嗜酸性胞漿內(nèi)包涵體，染成
藍色，位于上皮細胞內(nèi)。
2立克次體形態(tài)及染色性
將斑疹傷寒立克次體給小白鼠腹腔注射，發(fā)病后取腹水涂片，姬姆薩氏染色，鏡
檢。鏡下可見完整或破碎細胞，細胞核呈紫紅色或紫色，細胞漿呈淺藍色。在大單核細胞漿
內(nèi)見有大量紫紅色球桿狀立克次體，多位于細胞漿內(nèi)，呈藍色或紫紅色。
3肺炎支原體菌落觀察
肺炎支原體在營養(yǎng)豐富的固體培養(yǎng)基上增殖多代后在低倍鏡下觀察，其菌落呈“油煎荷包蛋
”狀，菌落中心部分長入培養(yǎng)基中，且較致密，周圍環(huán)繞扁平、透明的邊緣區(qū)。
4鉤端螺旋體暗視野檢查法
暗視野顯微鏡是將普通光學顯微鏡換裝上特制的暗視野聚光器或者在普通光鏡聚光器上加一
塊中央遮光板改裝而成。由于光線不能通過聚光器的中心部位透入物鏡，而只能從周邊斜射
經(jīng)標本反射進入物鏡，因此視野背景是暗的，標本成為亮點。使用暗視野顯微鏡可檢查不經(jīng)
染色，在普通顯微鏡下不易看清的活體微生物，如活的細菌、螺旋體等，它的缺點是不能觀
察生物體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。
將鉤端螺旋體培養(yǎng)液置清潔載玻片上，加蓋玻片后，用暗視野顯微鏡觀察，可在黑色的視野
中看到發(fā)亮、運動的鉤端螺旋體。
十一病原性真菌的檢查
【實驗目的】
1了解病原性真菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)特點和淺部真菌的檢查原則。
【實驗原理】
真菌是一類不含葉綠素，無根、莖、葉分化，由單細胞或多細胞組成，行有性或無性繁殖的
真核細胞型微生物。真菌的種類繁多，大多數(shù)對人類有利，僅少數(shù)對人和動物致病，稱之為
病原性真菌，包括淺部真菌和深部真菌兩大類。真菌的微生物學檢查，通常采用直接鏡檢和
培養(yǎng)檢查，根據(jù)真菌特殊的菌絲、孢子形態(tài)和菌落特征來確定真菌的種類。
真菌的菌絲從結(jié)構(gòu)上可分為有隔菌絲、無隔菌絲；從生長上分為營養(yǎng)菌絲、氣中菌絲；從形
態(tài)上可分為梳狀菌絲、球拍狀菌絲、鹿角狀菌絲、結(jié)節(jié)狀菌絲、假菌絲等。真菌的無性孢子
可分為分生孢子(大分生、小分生孢子)和葉狀孢子(芽生孢子、關節(jié)孢子和厚膜孢子)。真菌
的菌落形態(tài)有酵母菌落、類酵母菌落和絲狀菌落。
【實驗內(nèi)容和方法】
一淺部真菌病臨床標本(皮屑)檢查
1標本的采�。簶吮静扇∏�，應忌用藥。發(fā)癬患者，可用拔毛鑷子拔取脆而無光澤、易折
斷或帶有白色菌鞘的病損部毛發(fā)；手、足、體、股癬宜用鈍刀輕輕刮取損害部位邊緣皮屑；
甲癬可用小刀刮取病損指(趾)甲深層碎屑。
2標本制作：取少許皮屑或毛發(fā)標本于載玻片上，滴加10%氫氧化鈉(鉀)溶液1滴，加蓋玻
片，置火焰上微微加熱(以角質(zhì)細胞溶解，標本透明為宜)，約5分鐘。用鑷子輕輕加壓蓋玻
片，使皮屑鋪開變薄，驅(qū)除氣泡，用濾紙吸取周圍溢液。
3鏡檢：將制好的標本片置鏡下，先用低倍鏡下觀察，如疑為菌絲孢子，將視野轉(zhuǎn)向高倍
鏡下觀察。
【思考題】
1、為什么菌絲、孢子絲常作為真菌病診斷的主要依據(jù)?
2、怎樣診斷癬?防治原則有哪些?
(龍北國張文炳趙衛(wèi))
