第12章 抗病毒治療新技術
病毒感染性疾病是嚴重危害人類健康的常見病。在人類每年流行的傳染病中,由病毒引起的約占75%。病毒感染后可引起急性感染,亦可引起持續(xù)性感染,并與一些腫瘤、自身免疫性疾病、內分泌疾病及神經(jīng)性疾病的發(fā)生有一定的關系。目前,絕大部分病毒性疾病,特別是慢性病毒感染仍缺乏有效的治療措施。因此,探索新的抗病毒藥物和治療方法已成為醫(yī)學研究的熱點之一。
近年來,隨著分子生物學技術的迅速發(fā)展,以及對病毒生物學特性和致病機制認識的不斷深入,人們能夠在基因水平上尋找抗病毒治療的新途徑,逐漸建立了抗病毒基因治療技術,并在應用基因工程技術生產新型抗病毒藥物等方面取得重要進展。
基因治療(gene therapy)是指通過基因轉移或基因修飾方法,將具有表達功能的基因導入到相關細胞和組織中,使轉錄或翻譯的產物發(fā)揮治療作用的一種治療方法。進行基因治療時,應根據(jù)宿主細胞病變基因表達水平的異常狀況,采取不同的策略,以提高或補足表達水平低下的基因,或降低表達水平過高的基因,或對在正常狀況下不表達的基因進行封閉或破壞。
基因置換(gene replacement) 是把正常的外源基因導入生物體靶細胞內,對產生疾病的基因進行置換。理想的基因治療方式是,將缺陷基因原位校正,并保證患者基因組序列不發(fā)生其他改變,能接受體內原有的復雜調控,維持原有的時空表達模式。
基因修正(gene correction) 是將致病基因中發(fā)生突變的堿基部分予以更換或原位修復致病基因的功能,并不一定改變致病基因的核苷酸順序。這種治療方法頗具吸引力,但是,原位修正基因的策略目前在技術上尚存在許多困難。
基因修飾(gene augmentation) 是將有功能的目的基因導入到發(fā)生病變或正常細胞,目的基因的表達產物能補償致病基因的功能,但致病基因本身并未得到改變。與基因置換和基因修正策略相比,基因修飾容易實現(xiàn),因此,該策略目前在基因治療中得到廣泛應用。
基因失活(gene inactivation) 是應用各種手段封閉或阻斷致病(有害)基因的表達。對于病毒感染性疾病來說,基因失活是一種具有很好應用前景的基因治療策略。因為從基因水平上將病毒的基因組封閉或破壞后,就不能有效地表達病毒抗原,從而不會產生免疫病理反應。
基因疫苗(gene vaccine) 是用表達載體導入病原體抗原基因,表達的目的蛋白可誘導保護性粘膜免疫、體液免疫和細胞免疫應答,或打破對某種病原體感染所引起的免疫耐受,以達到預防和治療疾病的目的。
基因治療必須具備以下3個條件:
目的基因的獲得 主要方法有:cDNA的克隆,基因的人工合成,基因的聚合酶鏈反應(PCR)擴增及染色體基因組DNA的降解與克隆等方法。目前基因治療中應用的目的基因多數(shù)是cDNA。
靶細胞的選擇 基因治療的靶細胞有二大類:生殖細胞和體細胞。目前體細胞比生殖細胞的基因治療發(fā)展得更為成熟。靶細胞的選擇條件為:根據(jù)基因異常表現(xiàn)的器官及其部位;易取出和移植;易在體外進行培養(yǎng);體外易被轉導;具有較長的壽命。
基因轉移的方法 將外源性基因導入靶細胞的技術可分為物理、化學和生物學方法三大類。物理化學方法有磷酸鈣共沉淀法、脂質體法、微注射法、顆粒轟擊(基因槍)以及電穿孔法等,其優(yōu)點是簡單易行,缺點是攜帶的遺傳物質在細胞內易受DNA酶降解,且不易穩(wěn)定地存在于細胞基因組中。生物學方法主要指病毒介導的基因轉移,包括逆轉錄病毒(RV)、腺病毒(AdV)、腺病毒相關病毒(AAV)、單純皰疹病毒(HSV)、痘苗病毒(VV)等,特點是基因轉移效率較高,已成為基因治療應用最廣、最有效的基因轉移方法。
基因治療方式主要有兩類:一類是直接體內轉移(in vivo),亦稱活體直接轉移,是將帶有遺傳物質的病毒、脂質體或裸露DNA直接注射到試驗個體內;另一類是間接體內轉移(ex vivo),亦稱回體轉移,是在體外將目的基因導入到一定的細胞中,使其表達和分泌特定的重組蛋白,然后將這些經(jīng)遺傳修飾的細胞輸回試驗個體內。
exvivo方法較常用,效果較易控制,但步驟多,技術復雜難度大,不易推廣;in vivo方法尚未成熟,存在轉移效率低、療效短等問題,但操作簡便,容易推廣,是基因轉移研究的方向。只有invivo基因轉移方法成熟了,基因治療才能真正走向臨床。
病毒感染性疾病是病毒與宿主細胞相互作用執(zhí)業(yè)醫(yī)師的結果,因此,抗病毒治療應采取既針對病毒,又針對宿主的綜合措施。在應用抗病毒制劑抑制或終止病毒在細胞內增殖的同時,還需通過提高宿主的免疫應答,清除體內游離病毒和受病毒感染細胞,從而達到治愈病毒感染的目的。在眾多有潛在應用價值的新型抗病毒治療策略中,抗病毒基因治療技術尤為令人矚目,它是基因治療理論和方法在控制病毒性疾病領域的一個重要應用,同時,抗病毒感染基因治療的研究和應用又豐富和發(fā)展了基因治療的理論和技術。
在抗病毒感染基因治療領域,基因修飾和基因失活是目前應用的主要策略。針對提高人體對病毒的免疫力,采用基因修飾技術,將抗病毒的基因導入宿主得到表達;針對降低或消除病毒的致病力,從分子水平上抑制或封閉病毒基因的復制和表達。因此,抗病毒基因治療策略可以概括為3個方面。
增強宿主免疫力 利用基因轉移技術,將目的基因導入體內使其表達,表達的病毒抗原刺激宿主產生抗病毒免疫反應。宿主免疫力具有抵抗病毒感染并從病毒感染中恢復的重要功能。設法將受病毒感染細胞在病毒基因復制和表達之前將其破壞,使病毒不能包裝成完整的病毒顆粒,這是設計細胞自殺基因治療的思路。同時要求將所有受病毒感染的細胞殺死,但對正常細胞沒有影響。設計細胞自殺機制主要有三個途徑:病毒主導性酶藥物預施療法(VDEPT)、白喉毒素基因表達及細胞凋亡。
促進抗病毒蛋白的產生 將抗病毒蛋白基因導入病人末梢血淋巴細胞或造血干細胞后,再將轉基因細胞回輸病人體內,通過細胞表達和分泌的抗病毒蛋白進行抗病毒治療。例如,將可溶性CD4蛋白和IgG蛋白的融合基因或干擾素、白細胞介素等細胞因子基因導入細胞中表達。
細胞內免疫 在感染或非感染細胞內導入某種基因,通過表達的目的蛋白抑制病毒復制和表達,達到抗病毒治療和預防的目的,即對其中已感染的病毒具有抑制或阻斷作用,或對病毒感染的攻擊具有抵抗力。針對這類轉導的細胞來說,好像是對病毒的感染具有一定的免疫力。但這種形式的抗病毒免疫是由于細胞內目的基因的表達而產生的,故稱之為細胞內免疫(intracellularimmunization),主要有RNA誘餌(RNA decoy)、反義RNA、核酶(ribozyme)、病毒顯性突變蛋白和細胞內抗體(intracellularantibodies)等方法,已成為抗病毒感染基因治療的主要策略。
以堿基配對方式結合、抑制、封閉或破壞基因結構及表達活性的核酸分子,稱為反義核酸分子(或稱“基因封條”),包括反義DNA和反義RNA。研究反義DNA或反義RNA的來源、性質及其作用機制的技術稱為反義技術(antisense technology)。隨著反義技術的不斷發(fā)展,從反義DNA、反義RNA,已發(fā)展到具有酶催化作用的核酶(ribozyme)和多靶位核酶(multi-targetribozyme)RNA分子,使反義分子的類型不斷增多。
繼發(fā)現(xiàn)核酶、反義RNA之后,近年有關小干擾RNA(21-25bp)及其所致的RNA干擾(RNA interference,RNAi)現(xiàn)象又成為研究熱點。由于小干擾RNA與對應的mRNA特異結合后,可降解mRNA,因此,可有效地抑制靶基因的表達。RNAi是宿主對外源核酸(如病毒基因)侵入的一種保護性反應,將為病毒感染性疾病的防治提供新手段。
反義DNA、反義RNA、單靶位核酶和多靶位核酶識別底物DNA/RNA分子都是基于堿基配對原則,在基因水平阻斷病毒基因復制和表達,因此,反義技術的特異性很高,對宿主細胞幾乎無損害作用。反義技術抗病毒感染的機制主要包括以下幾個方面:
阻斷或抑制病毒DNA的復制與轉錄 在病毒DNA的復制和轉錄過程中,雙鏈DNA可解離成為單鏈狀態(tài)。反義DNA片段可與DNA雙鏈中的一股以堿基配對方式,形成DNA三聚體(triplet)結構,從而抑制或阻斷DNA的復制和轉錄,達到抗病毒治療的目的。
阻斷RNA的轉運 病毒的基因組進入細胞核中,與細胞基因組整合或呈游離狀態(tài)。病毒基因的轉錄產物需透過核膜轉運至胞質中,經(jīng)加工后進行翻譯。如果病毒的RNA不能正常有效地轉運到胞質中,就不能進行復雜的轉錄后加工。未經(jīng)轉錄后加工的mRNA是不能正常進行翻譯的。反義RNA亦在細胞核內進行轉錄,它可與病毒的RNA互補結合,發(fā)生RNA的轉運扣留。
阻斷RNA的轉錄后加工 病毒轉錄產物RNA在形成翻譯復合體之前,需要進行一系列的加工修飾過程,例如,乙型肝炎病毒(HBV)的mRNA需要在多個位點上進行剪切,以形成結構和大小合適的翻譯模板RNA,3'端加poly(A)。反義RNA與病毒的RNA結合,可以阻斷這種轉錄后的加工過程,故稱之為轉錄后的加工抑制。
翻譯抑制 病毒mRNA與核糖體RNA形成翻譯復合體后才能進行翻譯,其結合方式主要有2種:
1.帽狀結構依賴性的掃描機制(cap-dependentscanning mechanism,CDSM) 又稱為滑動機制,核糖體RNA與mRNA的帽狀結構結合與扣留,則順著模板mRNA從5'端向3'端方向掃描或滑動,當遇到第一個翻譯的起始密碼子,就可啟動翻譯過程。直到遇到終止密碼子時,翻譯才會終止。
2.內部核糖體進入位點(internalribosome entry site,IRES)方式 即帽狀結構非依賴性的翻譯過程。核糖體RNA直接尋找并結合IRES序列,形成翻譯復合體,從一個合適的起始密碼子開始翻譯。
以上二種翻譯機制都需要核糖體RNA與起始密碼子上游的RNA模板序列相結合。如果反義分子與此部位上的模板核苷酸首先結合,就可阻斷翻譯復合體的形成,進而抑制或阻斷病毒蛋白的翻譯。
破壞病毒RNA 反義技術破壞病毒的RNA有2種主要機制:
1.反義分子與靶mRNA鏈結合后,可激活內源性的核糖核酸酶如RNaseH等。RNase H可識別、分解DNA-RNA或RNA-RNA雙鏈分子中的RNA鏈,以破壞病毒的逆轉錄、加工、翻譯及轉運過程。
2.核酶RNA分子可利用其活性中心兩側的側翼序列與作為底物的靶RNA結合,并能識別特異的核苷酸序列,將其裂解。如果設計的是多靶位核酶RNA分子,就可在多個位點上將底物RNA分子進行切割,成為多個碎片。
反義核苷酸(antisense oligonucleotide,ASON)包括反義DNA和反義RNA,前者是指人工合成的、與靶基因某一區(qū)段互補的、正;蚪(jīng)化學修飾的DNA片段,后者是指一類能與靶mRNA互補結合的RNA分子,可參與基因表達的負調控,抑制特異基因的表達。反義RNA可在體內表達或體外合成。反義寡核苷酸作為基因表達的反向抑制劑,應具備足夠的穩(wěn)定性;對目的基因的選擇性;對細胞的通透性及靶向性,故應在化學修飾、序列選擇、靶向轉運等方面加以完善。
近年來,國內外已有大量應用ASON在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中成功地抑制人類免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒、皰疹病毒、流感病毒、人乳頭瘤病毒、Rous肉瘤病毒等感染的研究報道。
在AIDS的基因治療中,通過表達有關的互補核酸,以抑制HIV基因的復制、轉錄和翻譯。例如,應用內源性合成的tat、rev、vpu、gag或5'端的引物結合位點等基因的反義RNA,在體外培養(yǎng)的細胞系和CD4+淋巴細胞中均可抑制HIV-1感染。Tat蛋白是一種反式激活的轉錄因子,可與HIV-1長末端重復序列TAR位點(tat效應元件)結合,使HIV-1基因表達升高1000倍以上,因此,利用針對TAR的反義RNA可作為一種有效的HIV轉錄抑制劑。例如,針對HIV-1TAR序列,構建表達反義TAR的重組逆轉錄病毒載體,將重組體轉染Sup T1細胞后,再用HIV-1病毒株攻擊,Sup T1細胞內HIV-1病毒顆粒數(shù)量明顯減少。又如,將反義tat基因導入抗原特異性CD4+淋巴細胞,同樣可以抑制HIV的復制。
有學者構建了一種新的反義類型,即反義tRNA,直接針對HIV-1tat基因第一個編碼外顯子核苷酸序列(5 924~5 943 nt),該序列在大多數(shù)HIV-1分離株中高度保守。不改變tRNA的四環(huán)結構而將抗tat反義序列插入到一個tRNA骨架中,再用逆轉錄病毒載體將此反義tRNA導入Jurkat細胞株,結果能有效作用于靶位,表現(xiàn)出明顯的抗HIV從頭感染(denovoinfection)。這是首次將反義tRNA用于HIV-1感染的基因治療。該策略具有轉錄體為聚合酶Ⅲ啟動子所驅動、反義RNA穩(wěn)定性高等顯著特點。
核酶(ribozyme)是一類具有雙重特性的RNA分子,一是能識別特異的靶RNA序列并與之結合,具有反義核酸的特性;二是具有酶活性,能通過特異性位點切割降解靶RNA序列。核酶比反義RNA的阻斷活性至少高100倍,它作為抗病毒基因治療的新型分子,已受到廣泛的重視,成為抗病毒基因治療研究中重要的探索方向。
從分子結構上,核酶主要分為錘頭狀核酶和發(fā)夾狀核酶,兩者均能催化異體靶RNA的剪切反應。錘頭狀核酶結構簡單,長約30bp,含有一個保守的活性中心和與底物RNA互補的側翼序列,易于人工設計,所以目前合成的大多是錘頭狀核酶。
在基因治療中,主要是在體外設計核酶的編碼基因,以逆轉錄病毒等載體導入到靶細胞中進行表達,再通過核酶切割靶RNA分子,從而阻斷病毒特定基因的表達(圖11-10)。這一策略經(jīng)較為周密的細胞及動物水平的系統(tǒng)研究,已用于抗HIV基因治療的臨床試驗,并對肝炎病毒、流感病毒、人乳頭瘤病毒、鼠白血病病毒等進行了研究。
根據(jù)HIV調節(jié)基因和結構基因的特點,經(jīng)人工設計與核酶隨機文庫篩選,已獲得多種發(fā)夾狀或錘頭狀的抗HIV-1核酶,其中一些核酶已進入Ⅰ期臨床試驗階段。例如,將靶向HIV-1前導序列U5區(qū)(連接mRNA帽狀結構的起始區(qū))和pol基因的兩種發(fā)夾狀核酶的基因克隆到Moloney小鼠白血病病毒(MoMLV)中,轉染AIDS患者CD4+T淋巴細胞,然后自體回輸給病人。在對3例病人為期9個月的研究中,觀察了治療方案的安全性、轉染核酶的淋巴細胞在體內的存活期和動力學指標、核酶在體內的表達水平,以及核酶對體內病毒載量、病毒mRNA表達、CD4+T淋巴細胞水平的影響,結果表明,給病人回輸轉染了核酶的自體淋巴細胞是安全的;在回輸初期,內源性CD8+細胞、NK細胞和自體回輸?shù)腡細胞進行了復雜的重新分布。又如,采用靶向HIV復制過程中關鍵性調節(jié)蛋白Tat的錘頭狀核酶,通過MoMLV將核酶導入自體CD34+造血干細胞,再回輸給病人,結果是安全、有效的。
HIV-1基因組的高度變異性是核酶所面臨的最大挑戰(zhàn)。變異如果發(fā)生在核酶的切割位點上,則形成抗核酶的突變株。因此,對于HIV-1這樣一個長達近萬個堿基且突變率極高的逆轉錄病毒,在核酶的設計中必須注意以下幾點:
1.選擇高度保守的RNA切割位點 目前已分別設計出針對HIV-1 RNA中LTR、gag、tat、pol、env、vif、nef等不同高保守序列的核酶,實驗結果令人鼓舞。例如,選擇HIV-1基因組中高度保守的tat或tat+rev基因作為靶RNA,設計錘頭狀核酶,用逆轉錄病毒載體將核酶基因轉入人T淋巴細胞中,結果發(fā)現(xiàn)表達核酶的T細胞能成功地抵抗HIV-1感染。
2.多切割位點同時作用 鑒于多個靶位點同時突變的頻率比單個點突變的頻率要小得多,且只要有一個切割有效就能破壞HIV-1RNA,因此聯(lián)合應用作用于不同靶點的連接型或獨立型核酶,可大大提高切割效率,對于消除HIV-1高度變異帶來的不利影響是非常有效的。
3.核酶基因可與其它具有治療作用的基因協(xié)同發(fā)生抗HIV-1作用。
可以相信,隨著運用逆轉錄載體技術的提高,對核酶進行化學修飾,及陽離子脂質體導入技術的發(fā)展,核酶抗病毒基因治療途徑將發(fā)揮更大的作用。
除了上述直接針對病毒的基因治療研究外,通過導入病毒抗原基因誘生保護性抗體,或導入免疫調節(jié)因子基因及其誘導基因等,提高宿主的免疫功能,特別是CTL的殺傷活性,清除受病毒感染細胞等,是發(fā)展抗病毒基因治療的另一有效手段。主要方法有:體內直接注射DNA、抗原基因導入、自殺基因導入及基因替代的CTL過繼免疫等。目的基因在細胞內高效表達是實現(xiàn)抗病毒治療的關鍵,應從載體和啟動子的優(yōu)化、轉送基因方法的改進等方面進行深入研究。
直接注射DNA又稱核酸免疫(nucleicacidimmunization),是近年來從基因治療研究中衍生而發(fā)展的一個新領域(見第13章)。病毒核酸免疫是將病毒基因直接輸入病人組織,以模擬自然感染而激發(fā)抗病毒免疫應答。核酸疫苗可為裸露的閉合環(huán)狀質粒DNA或非復制的逆轉錄病毒載體形式。目前正在研制流感病毒、單純皰疹病毒、艾滋病病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、狂犬病病毒等核酸疫苗。
HBV的核酸疫苗采用HBsAg和HBcAg的基因,分別構建表達載體,或構建兩種蛋白的融合基因,它們均能誘導小鼠產生特異性體液免疫和細胞免疫應答。HCV的DNA疫苗研究主要集中在衣殼蛋白以及非結構蛋白3(NS3)等編碼基因區(qū),但也有少數(shù)研究采用包膜區(qū)E1和E2區(qū)進行基因免疫。
HIV的核酸免疫主要集中在編碼包膜糖蛋白的基因區(qū)。給多種動物注射HIV-1env、tat、rev基因,結果證實動物組織內能表達HIV蛋白,激發(fā)細胞免疫和體液免疫應答。將攜帶有HIV env和rev基因的逆轉錄病毒載體直接肌肉注射小鼠、獼猴和狒狒,三種動物產生特異針對gp120和Rev蛋白的MHCⅠ類分子限制的CD8+T細胞反應,CTL反應可長時間存在。由于rev基因的高度保守性,使針對Rev蛋白決定簇的特異性免疫應答能交叉作用于不同的HIV-1臨床分離株,因而具有特別重要意義。美國FDA已經(jīng)批準這種DNA免疫模式用于HIV感染者臨床試驗。核酸免疫的最大優(yōu)點是對變異迅速的病原微生物提供交叉防御作用,因此,有望研制出對HIV變異株有效的核酸疫苗,用于HIV感染的防治。
病毒的多種抗原成分可刺激宿主產生一種或多種不同類型的抗體,具有免疫保護作用,這與免疫清除病毒的過程密切相關。因此,將誘生保護性抗體的抗原編碼基因導入人體細胞并進行高效表達,也是抗病毒基因治療的一條重要途徑。
研究表明,HIV包膜糖蛋白是誘發(fā)宿主產生保護性抗體的主要抗原成分,可作為預防HIV感染的疫苗。應用逆轉錄病毒載體將HIV-1 gp120基因導入小鼠纖維母細胞系,然后用轉染細胞免疫同源小鼠,結果獲得MHC限制性的、針對gp120的特異性CTL細胞。將這些CTL輸給帶有表達HIV-1衣殼抗原的患腫瘤小鼠,可觀察到這些腫瘤細胞被CTL特異性殺傷,同時受免疫小鼠體內能產生抗gp120特異性中和抗體,抑制受感染的T淋巴細胞形成病毒合胞體,阻止HIV擴散。進一步用鼠和靈長類動物的自體細胞經(jīng)轉染后回輸?shù)襟w內,也獲得同樣的治療效果。以逆轉錄病毒載體介導的HIV包膜蛋白基因的轉移及表達保護性抗體的基因治療已進入臨床試驗。
將針對病毒某些組分的特異性抗體基因轉染靶細胞后,在細胞內表達的抗體可滅活內質網(wǎng)、胞漿和核內的靶蛋白的活性,從而抑制病毒的增殖。這類抗體稱為細胞內抗體(intracellular antibodies),其構建方法包括雜交瘤技術和抗體庫技術。
HIV通過包膜糖蛋白gp120與CD4+細胞表面的CD4分子、輔助受體相互作用而侵入細胞,造成CD4+細胞的數(shù)量減少,甚至完全喪失。因此,保護CD4+細胞不受感染的策略之一是,導入HIV-1抗體的基因,表達特異性抗體,中和HIV的感染性。例如,將抗gp120抗體基因克隆到LTR啟動子部位,可因HIV感染而誘導表達?筭p120單鏈抗體可在內質網(wǎng)上與CD4分子競爭結合HIV-1gp120,并阻止病毒向細胞膜轉運,從而抑制HIV的復制。該單鏈抗體由重鏈的引導序列、可變區(qū)與輕鏈的可變區(qū)通過連接子融合而成。由于單鏈抗體在沒有相應的另一條鏈的情況下將滯留于內質網(wǎng),故可將與該單鏈抗體結合的gp120引到內質網(wǎng),從而減少其表達。
將HIV-1的cDNA與Gag單鏈抗體基因插入到逆轉錄病毒載體,轉染T淋巴細胞,發(fā)現(xiàn)Gag蛋白表達水平并未改變,但胞內則無完整病毒顆粒存在。此外,針對Tat蛋白、Rev蛋白、逆轉錄酶、整合酶、內膜蛋白的細胞內抗體均可有效地干擾HIV-1的增殖。
以上結果提示,以HIV抗體的編碼基因作為目的基因實施基因治療是一條很有希望的途徑,尤其是在HIV生命周期的不同點阻斷其復制的細胞內抗體聯(lián)合療法對AIDS的治療更為有效。不過,HIV基因可編碼多種與致病性有關的結構蛋白和調節(jié)蛋白,它們作為抗原可激發(fā)宿主產生不同的抗體。為優(yōu)化細胞內抗體表達的抗HIV基因治療策略,獲得更為理想的治療效果,應選擇病毒生存所必需的表位(epitope),以減少HIV逃逸突變的發(fā)生;同時,須對各種抗體抑制或阻斷HIV感染的效果進行比較,以找到細胞內抗體的最佳靶點。
免疫因子特別是淋巴因子基因的導入,不僅是抗腫瘤的重要內容,同時也是抗病毒感染基因治療的重要內容。利用淋巴因子轉基因表達是基因治療在病毒性疾病中的一個重要應用和研究方向。
免疫因子的導入對HIV的感染有直接抑制作用。例如,將人α2干擾素(IFN-α2)基因重組在HIV LTR的啟動子下游,轉染Vero細胞系,分泌的IFN-α2水平在50~150u /ml,可明顯抑制HIV的復制和轉錄。而用相同劑量的外源重組IFN-α2則不能產生類似效果,提示體內產生的IFN-α2與體外重組的IFN-α2的抗病毒機制不同。如果在上述體系中加入HIV啟動子的反式激活劑Tat蛋白或者感染HIV,則可使IFN-α2的表達量分別提高到400u /ml和1000 u/ml。這一系統(tǒng)的另一個特點是,在反式激活因子不存在時,目的基因表達處于低水平,以減少因目的基因的持續(xù)高水平表達可能給宿主帶來的不良反應。同時,在受到病毒攻擊時,病毒提供的反式激活因子則促進目的基因的高水平表達,類似于人體生理的調控狀態(tài)。
其它種類的淋巴因子,特別是白細胞介素類的基因也是提高宿主免疫力、抵抗病毒感染的重要治療手段。
1988年Friedman等發(fā)現(xiàn),單純皰疹病毒(HSV)的反式激活蛋白VP16的缺失或截短突變體(truncatedform)具有明顯的抗HSV效應。截短突變體缺少野生型VP16羧基末端的78aa,仍能與野生型的HSV DNA結合,但失去了反式激活效應。能穩(wěn)定表達該突變體的細胞對HSV的復制具有明顯的抑制作用,即產生了免疫力,提示它可與病毒基因組中的順式激活序列結合,從而干擾相應的野生型蛋白的激活作用。因此,Baltimore于1988年首先提出“細胞內免疫(intracellularimmunization)”這一概念,即將人工構建的一個重組基因導入易感細胞內,表達病毒基因的反義核酸或病毒蛋白的突變體,以便有效地干擾野生型病毒的增殖。
抗HSV基因治療的策略同樣適用于抗HIV的基因治療。HIV同時具有反式和順式調節(jié)機制,HIV-1生命周期中必需的調節(jié)蛋白(Rev、Tat)和結構蛋白(Gag、Env)都有可能作為設計細胞內免疫的目的基因表達產物。目前,抗HIV基因治療的細胞內免疫法主要包括:HIV蛋白的修飾和RNA抑制劑的應用,前者主要有調節(jié)蛋白或結構蛋白修飾,后者主要包括RNA誘捕、反義RNA及核酶等技術。
(一)RNA誘捕
RNA誘捕就是通過某些與病毒調節(jié)蛋白具有同源性的RNA超表達,以螯合調節(jié)蛋白而抑制其調節(jié)功能,從而對病毒的復制和表達產生強有力的抑制作用。誘餌或引誘劑(decoys)方案的設計和應用要求誘餌RNA分子處于量的優(yōu)勢,即必須處于“過表達”狀態(tài)。
HIV復制與表達的調控過程涉及極為復雜的蛋白-核酸之間的相互作用,其中tat、rev是HIV復制的兩個主要調節(jié)基因,其表達產物Tat和Rev分別與病毒RNA的轉錄激活區(qū)TAR(tatresponsive element)和Rev效應元件(rev responsive element,RRE)結合,從而調控基因的轉錄(參見第11章)。因此,Tat-TAR和Rev-RRE在HIV生命周期中顯得十分重要,已成為HIV基因治療研究中的熱點之一。
應用RRE和TAR誘餌抗HIV基因治療的基本思路是:在HIV感染的靶細胞內高效表達一種與TAR或RRE相類似的短RNA,這些誘餌競爭性結合調節(jié)蛋白Tat與Rev,阻止調節(jié)蛋白與病毒基因組上的相應序列(TAR或RRE)結合,從而抑制HIV的復制、轉錄和翻譯。例如,將HIV-1的TAR或RRE的基因插入到攜帶polⅢ(tRNAmet)啟動子的逆轉錄病毒載體中,然后轉染人T細胞系CEM,獲得TAR和RRE超表達,結果在帶有這些基因的CEM T細胞中,HIV-1的表達受到抑制。
為了提高Tat序列的誘捕效應,可構建依賴于HIV的誘導性載體,該載體表達的多聚TAR(polyTAR)可與病毒TAR RNA競爭結合Tat蛋白,從而抑制病毒的復制。多聚TAR的表達受HIV LTR調控,活性依賴于HIV Tat蛋白的存在。隨著TAR串聯(lián)子數(shù)量的增加,病毒Tat介導的基因表達抑制率隨之增加,當TAR串聯(lián)數(shù)達50時,抑制率高達90%以上。
與反義RNA和核酶不同的是,RNA誘餌不受HIV變異的影響,因為TAR和RRE在不同HIV毒株中十分保守。不過,使用這些特定的誘餌RNA作為抗病毒的手段也可阻止與TAR或RRE相關的細胞因子,因此,TAR或RRE在細胞內表達有可能產生細胞毒效應而影響細胞功能。為了降低可能出現(xiàn)的細胞毒性作用,可設計僅含13bp的最小化RRE誘餌,保留其與Rev結合的結構域,抑制HIV的復制,但不能與細胞因子結合。
(二)調節(jié)蛋白修飾
HIV某些調節(jié)蛋白經(jīng)突變或修飾后,失去調節(jié)功能,但可與天然病毒蛋白競爭結合其目標位點,從而干擾病毒的正常復制,發(fā)揮抗病毒效應。HIV的調節(jié)蛋白主要是Tat、Rev,其中Tat為反式激活蛋白,能結合到病毒RNA的tat序列上,促進細胞的RNA聚合酶Ⅱ對HIV前病毒的轉錄;Rev蛋白則在啟動HIV病毒結構蛋白和蛋白酶的合成過程中起關鍵作用。因此,可將突變修飾后的調節(jié)蛋白基因導入HIV感染的靶細胞中,表達相應的顯性突變蛋白,干擾HIV感染和復制過程,使細胞免受HIV感染。
Tat蛋白突變株 通過缺失tat基因導致其編碼產物Tat蛋白無RNA結合或核定位特性,但仍保留活性結構域,結果發(fā)現(xiàn)突變的Tat蛋白可抑制HIV的基因表達。構建表達雙功能RNA(多聚tat和反義tat)的抗tat基因,已成功地用于螯合Tat蛋白的功能及阻斷tatmRNA的翻譯。據(jù)報道,tat突變體在原代細胞中能控制HIV-1的復制,可在體外感染HIV的正常人外周血單核細胞(PBMC)或者經(jīng)激活的HIV-1陽性病人的PBMC中觀察到這一現(xiàn)象。
tat突變體的抗病毒作用限于低病毒載量,提示可望用于無癥狀期的HIV感染者的治療,以控制細胞內病毒的復制而阻斷病毒的傳播。
Rev蛋白突變株 在調節(jié)蛋白中,對突變的Rev蛋白M10研究較多。運用定點突變技術,構建Rev突變體Rev M10(Leu78Glu79→Asp78Leu79),改變該蛋白C末端富含亮氨酸結構域的穩(wěn)定性,使Rev蛋白喪失其調節(jié)功能,但不影響其與Rev 效應元件RRE的結合特性和形成多聚體的功能。野生型的Rev可形成多聚體,與RRE結合后,通過其調節(jié)區(qū)域促進未經(jīng)剪接和經(jīng)單一剪接的病毒mRNA從核內轉移到胞漿中,以便表達病毒包裝所需的結構蛋白。而突變的RevM10則可與野生型Rev競爭性與RRE結合,故HIV的復制和表達受到抑制。
利用Moloney鼠白血病病毒為載體,將RevM10基因導入到人T細胞系CEM,可穩(wěn)定表達Rev M10,并能抵抗HIV-1感染;將Rev M10基因導入人原代T細胞,亦可促進該細胞獲得抗HIV感染的能力。
新近報道,用構建的反式顯性Rev突變體(transdominantRev,Rev-Td)插入逆轉錄病毒載體,分別轉染Sup T1細胞株和正常CD4+T細胞,然后用不同的HIV-1病毒(包括HIV-1IHB和MN株及病人初代分離株)攻擊,結果這些細胞表達Rev突變體(包括點突變和讀框移位)后,HIV-1 gag mRNA的轉錄和病毒的復制均顯著降低,細胞不被病毒破壞。進一步與反義TAR及反義Tat/ Rev轉染的Sup T1細胞株醫(yī)學三基和正常人CD4+T細胞的實驗結果比較,發(fā)現(xiàn)Rev-Td能保護70%細胞免受HIV-1的感染,比反義RNA的保護作用(30%~50%)強。應用RevM10突變體等對HIV感染者進行臨床治療的計劃已在進行,利用逆轉錄病毒載體轉移抗病毒基因可用于AIDS病人的免疫重建。
(三)結構蛋白修飾
通過結構蛋白的修飾亦可顯著干擾HIV前病毒的復制。Gag蛋白在成熟病毒顆粒中以高度多聚化形式存在,該結構的缺失導致HIV不能復制,因此,將Gag蛋白突變體基因導入宿主細胞后可獲得表達并抵抗HIV感染。
Env蛋白則是另一被修飾的靶子。例如,將HIV的gp41跨膜蛋白的第2位纈氨酸用谷氨酸取代,構建成Env突變體,再將該突變體基因導入T細胞系內,結果顯示,這些細胞系不僅可抵抗野生型HIV-1引起的細胞病變效應,而且降低了HIV前病毒的復制,其機制可能是通過干擾包膜糖蛋白多聚體與受體復合物的疏水性相互作用。又如,gp120上與CD4分子結合的序列被切除后,Env突變體將不再結合CD4分子,并可干擾野生型HIV的復制。
值得注意的是,突變蛋白的作用是抑制病毒表達或干擾病毒成熟,其發(fā)揮效應的階段是在病毒感染整合以后,對感染早期沒有抑制效應。由于表達的是外源性蛋白,有可能激活免疫系統(tǒng)產生CTL而破壞突變蛋白的表達細胞。
設計清除病毒感染細胞而非單純干擾病毒的復制和表達過程是基因治療研究的另一條重要思路,因此,導入自殺基因(suicide gene)以清除病毒感染細胞在基因治療中占有重要地位。其基本策略是,將自殺基因導入細胞中,當沒有病毒感染時,自殺基因不表達,對正常細胞無損害作用;一旦受到病毒攻擊,病毒復制表達過程中的早期蛋白成分為自殺基因的表達提供反式激活劑,從而阻斷病毒復制與表達、病毒顆粒的裝配與成熟或在細胞之間擴散。
引起細胞自殺的基因種類較多,如某些病毒或真菌的一些酶類基因、白喉毒素基因、促進藥物代謝和轉換的基因、誘導細胞凋亡的基因等。自殺基因的導入可以有效地殺傷受病毒感染的細胞,但怎樣保證細胞自殺的范圍僅限于病毒感染的細胞,而對于正常細胞無不良反應是設計的關鍵。
HIV能逃逸宿主免疫系統(tǒng)的一個重要原因在于HIV進入CD4+淋巴細胞內增殖,當病毒顆粒成熟釋放后,可以從宿主細胞膜上獲得保護性外膜,從而再次逃脫宿主的免疫監(jiān)視。由于宿主自身的CTL反應不能完全清除受病毒感染的CD4+淋巴細胞,而且隨著病程的發(fā)展,CTL反應不斷減弱。因此,可利用自殺分子殺傷受病毒感染的淋巴細胞,使細胞內未成熟的病毒顆粒失去宿主細胞膜的保護,從而易于被機體及時清除。最常用的自殺基因有單純皰疹病毒(HSV)脫氧胸苷激酶(thymidinekinase,TK)基因和細菌毒素如白喉毒素基因。
脫氧胸苷激酶基因 HSV-tk基因與前體藥物丙氧鳥苷(ganciclovir,GCV)聯(lián)合是目前應用最廣的自殺基因系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn),將單純皰疹病毒脫氧胸苷激酶基因(HSV-tk)與潮霉素(hygromycin)抗性基因重組后,經(jīng)載體導入HIV-1特異的CD8+T細胞,在體外擴增后再回輸?shù)交颊唧w內。HSV-tk基因所編碼的TK酶可使無毒性的GCV磷酸化成核苷類似物GCV-P,后者在細胞酶作用下轉變成GCV-PP和GCV-PPP,GCV-PPP是毒性極強的三磷酸核苷類似物,它作為底物摻入到新合成的DNA鏈中,使DNA斷裂且抑制DNA聚合酶活性,從而阻斷DNA合成,導致分裂期的受病毒感染細胞死亡,達到治療HIV-1感染的目的。當輸入攜帶該融合基因的CTL后,一旦出現(xiàn)毒性副作用,即可給予GCV,殺死輸入的細胞,以保證安全。
可誘導性逆轉錄病毒載體的應用,為“自殺基因”準確殺傷HIV感染靶細胞創(chuàng)造了條件。將可受Tat誘導的TK表達系統(tǒng)經(jīng)逆轉錄病毒載體導入CD4+T淋巴細胞,tk基因可在受HIV感染的細胞中獲得高水平表達,在TK底物存在的情況下,可導致HIV感染細胞死亡和增殖抑制,阻止病毒在細胞間的傳播。運用腺病毒載體構建相似的HSV-tk基因表達載體,用該重組載體轉染有Tat表達的T細胞和Hela細胞系,當再給予GCV時可使這些細胞死亡。
HSV-tk/GCV系統(tǒng)不僅能殺滅表達HSV-TK的病毒感染細胞,也能誘導相鄰的不表達tk基因的細胞死亡,這一現(xiàn)象稱為“旁觀者效應”(bystander effect),從而擴大了自殺基因的殺傷作用,同時增強了轉染效率。“旁觀者效應”的產生機制可能是,轉染自殺基因的細胞產生殺傷性物質,通過細胞間隙連接(gapjunction)傳遞到臨近細胞,引起死亡。亦可能與細胞凋亡有關。
白喉毒素基因 自殺基因還包括編碼細胞毒素的基因,當該基因表達時細胞即被殺死,應用白喉毒素能實現(xiàn)該目的。白喉毒素由A、B兩個亞基組成,A鏈是毒素的毒性部位,可導致細胞因蛋白質合成障礙而死亡;B鏈是毒素的結合部位,與細胞表面受體特異性結合。
通過構建編碼白喉毒素A鏈基因的載體,用HIV的LTR控制基因的表達,同時表達結構中含有TAR序列及一段負調控序列,使A鏈基因的表達依賴于Tat和Rev雙重蛋白的作用。體外實驗證明,HIV敏感的TH9細胞系受該載體轉染后,對HIV毒株感染的保護力可持續(xù)59d,受感染的細胞群體產生病毒的能力大大下降,甚至用PCR方法也檢測不到病毒的存在,說明保護力是完全的。這是由于在病毒感染早期產生的Tat和Rev的作用,激活并表達白喉毒素,將受感染細胞殺死,因而不能產生足夠的病毒傳播至其它細胞?梢,細胞毒素基因治療是一種很有前途的抗HIV基因治療方法。
依賴于Tat和Rev雙重蛋白的白喉毒素基因載體有二大優(yōu)點:第一,毒素的表達是Tat和Rev雙重依賴性的,在HIV感染的細胞中轉染該載體能造成HIV復制的實質性抑制;第二,白喉毒素A基因表達的基礎水平顯著下降,降低了對正常細胞的毒性作用,提高了治療的安全性。
抗病毒藥物治療是抗病毒治療中的一個重要組成部分。由于病毒必須侵入宿主細胞內復制才顯示其生命活性和致病性,因此,設計抗病毒藥物或制劑的策略可分別從病毒感染細胞的吸附與穿入、脫殼、生物合成、裝配與釋放等不同環(huán)節(jié)篩選不同藥物。目前,抗病毒藥物主要包括化療藥物和干擾素,其中化療藥物可分為核苷類似物和非核苷類似物等。
核苷類化合物是最早用于臨床的抗病毒藥物,其作用機制主要有:
阻止病毒核酸鏈的延伸 DNA病毒與RNA病毒的復制均需要依賴宿主細胞提供核苷作為病毒DNA或RNA合成的原料。病毒能夠利用自身的核糖核酸還原酶,將細胞內RNA水解,再利用自身胸腺嘧啶核苷激酶將胸腺嘧啶核苷轉化為單磷酸胸腺嘧啶核苷,在細胞激酶作用下將單磷酸核苷轉化為二磷酸和三磷酸核苷而被病毒利用。核苷類似物抗病毒藥物可作為病毒復制的原料,在病毒特異的胸腺核苷激酶或類似酶的催化下,轉化為磷酸化的核苷類似物而摻入合成的病毒DNA或RNA鏈中。由于核苷類似物缺少3'羥基,或因其它修飾而不能使正在合成的病毒核酸鏈繼續(xù)延伸,阻斷病毒核酸的復制,故這些核苷類藥物被稱為“鏈終止劑”(chainterminitor)。
抑制病毒DNA或RNA聚合酶 許多核苷類似物抗病毒藥物與細胞內三磷酸脫氧核苷或三磷酸核苷競爭結合病毒DNA或RNA聚合酶,干擾病毒聚合酶與病毒復制模板和引物的結合,進而抑制病毒聚合酶的活性。
抑制病毒逆轉錄酶 某些核苷類似物可直接與病毒逆轉錄酶結合,抑制其活性。
核苷類似物抗病毒藥物主要用于皰疹病毒和逆轉錄病毒感染的治療,某些藥物也用于治療HBV和HCV感染。該類藥物的代表是齊多夫定(ZDV),是1987年獲美國FDA批準的第一個治療AIDS的藥物。目前用于臨床的有:雙脫氧肌苷(ddI)、雙脫氧胞苷(ddC)、司他夫定(D4T)和拉米夫定(lamivudine,3TC)等。其中,拉米夫定亦用于乙型肝炎和丙型肝炎的治療。另外,丙氧鳥苷(ganciclovir)可用于巨細胞病毒和皰疹病毒感染,無環(huán)鳥苷(acyclovir)和碘尿苷(IDU)用于皰疹病毒感染。利巴韋林(ribavarin,商品名病毒唑)可抑制多種RNA和DNA病毒復制。
非核苷類似物抗病毒藥物是一類非競爭性抑制劑,共同特性是不需要經(jīng)過磷酸化,作用靶點是逆轉錄過程。例如,通過與HIV-1的逆轉錄酶的活性中心或附近部位結合而抑制逆轉錄酶的活性。該類藥物能夠高度專一性地抑制HIV-1的逆轉錄酶,對HIV-2及其他逆轉錄病毒的逆轉錄酶抑制作用很低或無作用,主要有奈韋拉平(nevirapine)、得拉維拉定(delavivadine)、雙吡啶氮(TIBO)、吡啶酮(pyridones)等。非核苷類似物與核苷類似物聯(lián)用對HIV-1復制的抑制有協(xié)同作用。
蛋白酶抑制劑,又稱肽類似物抑制劑,主要模擬多蛋白水解部位的構型,在感染細胞內與多蛋白競爭結合蛋白酶,從而抑制蛋白酶的活性。蛋白酶抑制劑主要作用于病毒感染晚期,抑制病毒顆粒的成熟,使細胞只能產生非感染性病毒顆粒,因此可阻斷病毒傳播。
1996年美國FDA批準了3個蛋白酶抑制劑:利多那韋(ritonavir)、沙喹那韋(saquinavir)和印地那韋(indinavir)。這些藥物可減少病毒載量,增加CD4細胞計數(shù),主要用于HIV晚期感染者,單藥療效不佳,常與核苷類似物聯(lián)用。目前已研制出第二代蛋白酶抑制劑如ABT-378、amprenavir、sc521、sc51和CGP61755、KNI-272等。
種類 干擾素(interferon,IFN)是目前最常用的抗病毒藥物之一,其抑制病毒復制具有廣譜性、間接性、種屬特異性及受體依賴性。IFN主要包括α、β和γ3種。IFN-α和IFN-β為Ⅰ型,IFN-γ為Ⅱ型。三種IFN的細胞來源、誘生物、分子結構、抗原性和生物活性各不相同。IFN-α主要由腫瘤細胞、B淋巴細胞、NK細胞或巨噬細胞產生,有耐酸和不耐酸二種。IFN-β主要由病毒核酸或其它外源性核酸刺激纖維母細胞、上皮細胞或巨噬細胞產生。IFN-γ由抗原特異性T淋巴細胞產生。目前三種IFN的基因已被克隆和表達,臨床應用的IFN多為基因工程產物。
抗病毒作用機制 IFN誘生劑作用于細胞,使IFN基因活化,轉錄表達IFN蛋白。表達的IFN分泌到細胞外,與其它細胞或自身細胞上的IFN受體系統(tǒng)結合后,發(fā)生配體受體復合物的內在化和降解,激活未受感染靶細胞的抗病毒蛋白基因,表達各種抗病毒蛋白,使宿主細胞進入抗病毒免疫狀態(tài)而免受病毒感染。與IFN抗病毒有關的蛋白質主要有依賴RNA蛋白激酶(RNA-dependent protein kinase,PKR)、2'-5′腺嘌呤核苷合成酶(2′-5′-AS)、磷酸二酯酶、Mx蛋白、MHC抗原、β-微球蛋白和腫瘤壞死因子受體等。其中,前四種介導的抗病毒作用尤為重要。
1.依賴RNA蛋白激酶 又稱eIF-2蛋白激酶,IFN和病毒雙鏈RNA協(xié)同活化細胞內依賴RNA蛋白激酶;罨牡鞍准っ甘辜毎鹐IF-2的α亞單位磷酸化,干擾病毒蛋白質的起始翻譯。
2.2′-5′AS IFN誘導2′-5′AS基因表達,病毒雙鏈RNA使2′-5′AS活化;罨2′-5′AS將細胞內ATP轉化為許多寡腺苷酸,后者再激活細胞核酸內切酶,使病毒mRNA降解。
3.磷酸二酯酶 能降解2′-5′A為ATP和AMP,同時也水解細胞內tRNA末端的pCpCpA序列,從而抑制蛋白質的翻譯。
4. Mx蛋白 是由IFN-α和IFN-β誘導產生的75kDa蛋白,體外研究證實Mx蛋白能抑制流感病毒和水皰口腔炎病毒在細胞內的轉錄。
除抑制病毒蛋白質合成外,IFN對病毒感染的幾乎所有過程均有抑制作用,包括病毒的吸附、穿入、脫殼、復制、表達、裝配及釋放等。此外,IFN通過誘導細胞MHC抗原表達,增強宿主免疫反應等方式間接抗病毒感染。
應用 IFN主要用于治療HBV、HCV、HIV和皰疹病毒感染,其中IFN-α是目前唯一證實有效的慢性乙型病毒性肝炎的免疫治療藥物。治療初期,IFN主要通過誘導表達的抗病毒蛋白抑制病毒感染。用藥8~12周,患者常有轉氨酶的暫時升高,但血清病毒復制指標的滴度下降,與IFN調節(jié)宿主免疫反應引起的抗病毒作用有關。應用IFN治療HBV和HCV感染的臨床指征是:血清HBeAg、HBV-DNA和HCV-RNA中有一項陽性,或肝組織中HBcAg、HCV-RNA和HCV抗原中有一項陽性,患者處于肝功能代償期時,均可應用IFN治療。
隨著免疫學的進展,免疫調節(jié)劑及過繼免疫治療已被應用于病毒感染性疾病的治療,目的是試圖提高宿主免疫功能,增強抗病毒能力,改善病情,清除或抑制病毒。在臨床上使用較多的免疫調節(jié)劑有短棒菌苗、左旋咪唑、轉移因子、特異性免疫核糖核酸、真菌多糖、胸腺素、細胞因子等。
胸腺素(thymosin)是胸腺上皮細胞合成的多肽激素。目前臨床應用的有胸腺素F5(TF5)和胸腺素α1(Tα1),后者的生物學活性較前者高10~1000倍。胸腺素無種屬特異性,其主要免疫作用有:連續(xù)誘導T細胞不同亞群的成熟和分化,調整B細胞功能;調節(jié)免疫平衡作用;增強成熟T細胞、NK細胞對抗原的刺激反應,產生白細胞介素2、IFN等細胞因子。
作為一種生物反應調節(jié)劑,Tα1可明顯提高機體的免疫功能,近年已廣泛作為免疫增強劑,用于臨床治療各種免疫缺陷病、自身免疫病、腫瘤及病毒感染性疾病。
近年來,國內外用胸腺素治療慢性病毒性肝炎取得一定效果。鑒于單用IFN治療慢性HBV、HCV感染收效甚微,用Tα1與IFN聯(lián)合治療慢性病毒感染具有能使患者獲得更有效的組織學改善、病毒載量下降明顯、副作用較少等優(yōu)點。
許多細胞因子參與機體抗病毒免疫機制,其中最重要的是IL-2、IL-12 、IFN-α和GM-CSF。
白細胞介素(ILs)
1.IL-2 為人體最重要、作用最強的T細胞生長因子,能提高T細胞數(shù)量和活性以增強宿主的免疫功能,同時誘導增強NK細胞、LAK細胞和CTL效應,促進細胞增殖分化和多種細胞因子的表達。IL-2的抗病毒效應是由IFN-γ介導的,即通過對NK細胞、單核-巨噬細胞及T細胞的激活與趨化作用,誘導這些細胞釋放IFN-γ等細胞因子,起到抗病毒作用。
研究發(fā)現(xiàn),用IL-2每周2次肌注治療慢性乙型肝炎,12周后,57%患者HBVDNA載量降低50%以上,但對HBeAg消除不滿意。慢性丙型肝炎對IL-2的治療應答反應優(yōu)于乙型肝炎,初步結果顯示,部分病例ALT恢復正常,血清HCV RNA轉陰。
2.IL-12 是由巨噬細胞等抗原提呈細胞產生的一種異源二聚體細胞因子,主要生物學活性有:增強NK/LAK細胞的溶細胞活性;促進特異性CTL細胞應答;促進活化的T細胞、NK細胞增殖;誘導靜止及活化的T細胞及NK細胞、單核細胞分泌IFN-γ,發(fā)揮抗感染、抗腫瘤作用;尤其是具有調節(jié)Th1/Th2細胞之間的平衡。IL-12不僅對細胞免疫發(fā)揮作用,而且直接影響體液免疫,有顯著的免疫保護作用。
IL-12可通過增強病毒感染后的特異性和非特異性免疫應答而發(fā)揮抗病毒作用,對于多種類型病毒的復制和表達都具有抑制作用。受IL-12刺激的NK細胞和CTL細胞清除受病毒感染細胞的第一步是識別,這涉及MHC限制性的識別過程,而IL-12可以增強受感染細胞中MHCⅠ、Ⅱ類抗原的表達。體外IL-12的抗病毒活性能被抗IFN-γ的單克隆抗體中和,但不能被抗IL-12單克隆抗體所拮抗,說明IL-12的抗病毒作用很大程度上依賴于IFN-γ的誘生。IL-12對HSV、HIV、肝炎病毒感染有良好的治療作用,國外用IL-12治療AIDS、慢性丙型病毒性肝炎已進入臨床Ⅰ/Ⅱ期階段。
腫瘤壞死因子(TNF) 是一種具有廣泛生物學活性的細胞因子,主要由單核-巨噬細胞和T細胞產生,前者產生TNF-α,后者產生TNF-β。此外,B細胞、NK細胞等受刺激也能表達TNF-α或TNF-β,許多病毒能誘導宿主細胞產生TNF。研究表明,TNF能激活NK細胞,增強CTL識別受病毒感染細胞的能力及調節(jié)MHC分子表達,有選擇性地破壞受感染細胞,從轉錄和翻譯水平上有效地抑制病毒在細胞中的復制。值得注意的是,近年研究發(fā)現(xiàn)TNF能增加某些逆轉錄病毒復制。因此,TNF的作用復雜,具多樣性。
粒細胞巨噬細胞-集落刺激因子(GM-CSF) GM-CSF來源于激活的T細胞、單核-巨噬細胞、成纖維細胞與內皮細胞等,能促進造血細胞的增殖成熟,增強依賴抗體的細胞毒活性、細胞表面受體抗原表達,并刺激細胞因子的分泌,尤其是IFN-α等抗病毒細胞因子的釋放。
GM-CSF在乙型肝炎的治療和預防中具有十分重要的作用。應用IFN治療出現(xiàn)白細胞數(shù)減少的慢性乙型肝炎患者,改用GM-CSF和IFN聯(lián)合療法,結果使HBVDNA水平顯著降低,甚至轉陰,轉氨酶和組織學活性指數(shù)也顯著降低。國內外臨床研究表明,GM-CSF可抑制HBV DNA水平,增強機體抗HBV能力,與IFN聯(lián)用可更有效地清除HBV。
(一)以疫苗為基礎的免疫治療
多肽疫苗法 是指接種由明確抗原組成的最小結構,激發(fā)有效的特異性免疫應答,并避免可能的危害作用。研究發(fā)現(xiàn),HLA-A2陽性者HBcAg特異性CTL最佳識別位點在HBcAg18~27aa,因此提出用該肽作為合成肽疫苗進行免疫治療以終止病毒感染的設想。動物實驗表明,合成肽結合某些佐劑或脂質體,能有效地誘導出CTL反應。在正常人體內進行治療性HBV疫苗的Ⅰ期臨床試驗,獲得了該疫苗的有效劑量值范圍,同時觀察到注射4次后誘導的CTL反應持續(xù)超過9個月,并證實Th細胞活性在其中的重要作用。新近研究認為有必要聯(lián)合非特異誘導劑如IL-12、IFN-γ,以調節(jié)Th1/Th2型細胞的平衡,可在CTL水平打破其免疫耐受狀態(tài)。
核酸疫苗法 即直接注射DNA或RNA,這是一種簡單而有效的治療方法,原理是利用病毒不同的結構基因產物可誘發(fā)強烈的細胞免疫和體液免疫應答,同時誘導多個表位的CTL反應,可能對治療某些因基因突變而產生免疫逃避的病毒感染性疾病起重要作用(參見第13章)。
重組蛋白顆粒法 可溶性蛋白抗原免疫通常誘發(fā)CD4+細胞而非CD8+T細胞反應。研究證實,通過不同途徑注射重組裸S抗原顆粒,可在Balb/c小鼠體內誘導出MHCⅠ類分子限制性S蛋白特異性CD8+CTL應答。S抗原顆粒需要經(jīng)過一種新型的內體加工途徑才能發(fā)揮作用。在外源性蛋白抗原加工過程中,樹突狀細胞、巨噬細胞及外源性β2微球蛋白起重要作用。
(二)以抗原遞呈為基礎的免疫治療
抗原提呈細胞(APC)是宿主免疫應答的首要環(huán)節(jié),能否進行有效的抗原遞呈直接關系到免疫激活或免疫耐受的誘導。而樹突狀細胞(DC)是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強的APC,也是唯一能激活初始型T細胞的APC,在免疫應答的誘導中具有獨特地位,成熟后高表達MHCⅠ、Ⅱ類分子,同時提供充分的協(xié)同刺激信號,在與T細胞結合后強烈激活T細胞,分泌高水平IL-2,主導Th1型應答。DC用于腫瘤免疫治療,能顯著誘導宿主產生抗原特異性CTL。利用DC作為免疫佐劑,刺激宿主產生大量的特異性CTL,可為抗病毒治療開辟新的途徑。
DC用于病毒的免疫治療主要是通過體外用病毒抗原攻擊致敏DC,再回輸體內,誘導出病毒抗原特異性的CTL,殺傷病毒感染的細胞。用抗原致敏DC的方法有:通過病毒抗原多肽或蛋白直接沖擊DC;用滅活的病毒疫苗共同孵育或活病毒感染;用陽離子脂質體攜帶病毒蛋白或合成的雙鏈RNA沖擊等。有學者用HBV轉基因小鼠的免疫耐受模型進行了DC打破HBsAg耐受性的研究,用含HBsAgDNA疫苗只能在一部分小鼠刺激抗體反應,但無特異性CTL反應出現(xiàn);而用IL-4、GM-CSF活化骨髓來源的DC在所有小鼠均能刺激脾細胞CTL反應,并且活化的轉基因DC不需在體外用HBsAg沖擊,就能將S抗原內在化并提呈于CTL前體細胞,提示用細胞因子活化的DC進行抗原遞呈能夠打破免疫耐受狀態(tài),引發(fā)抗病毒CTL反應。
(王傳恩 中山大學中山醫(yī)學院)