生物化學與分子生物學-實驗指導:實驗六 凝膠層析分離血紅蛋白和維生素B2

實驗六  凝膠層析分離血紅蛋白和維生素B₂

【實驗目的】

掌握層析法的基本原理；熟悉凝膠層析技術(shù)的基本操作及其應用。

【實驗原理】

凝膠層析又叫分子篩層析，是利用凝膠將分子大小不同的物質(zhì)進行分離的方法。當分子大小不同的物質(zhì)通過凝膠時，由于凝膠顆粒內(nèi)部的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)具有分子篩作用，分子大小不同的溶質(zhì)就會受到不同的阻滯作用。本實驗用葡聚糖凝膠作支持物，用維生素B₂（黃色，分子質(zhì)量為376.36)和血紅蛋白（紅色，分子質(zhì)量為64500)混合物作樣品，在層析時，血紅蛋白相對分子質(zhì)量大，不能進入凝膠顆粒內(nèi)部，而從凝膠顆粒間隙流下，所受阻力小，移動速度快，先流出層析柱；維生素B₂相對分子質(zhì)量小，可進入凝膠顆粒內(nèi)部，洗脫流程長，因而所受阻力大，移動速度慢，后流出層析柱。這樣就可達到分離維生素B₂和血紅蛋白的目的。收集洗脫液后，在分光光度計上測定兩種組分的吸光度，繪醫(yī).學全在線制洗脫曲線。

【實驗試劑和器材】

1. 試劑

⑴葡聚糖凝膠SephadexG-25或SephadexG-50。

⑵0.2％維生素B2飽和水溶液 ：稱取維生素B₂ 0.2 g，溶于少量蒸餾水，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶,加蒸餾水至刻度。

⑶生理鹽水。

⑷血紅蛋白溶液：取草酸鉀抗凝血2 mL置離心管中，3000r/min離心5min，使血細胞沉淀，棄去血漿及白細胞層。向紅細胞沉淀加入生理鹽水4 mL，振搖洗滌，3000r/min離心5min，棄去上清液。向沉淀加入蒸餾水2 mL，混勻，猛烈振搖促使紅細胞溶血釋放血紅蛋白。即為上清血紅蛋白溶液備用。

⑸0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.2)：取0.1 mol/L磷酸氫二鈉720 mL和0.1 mol/L磷酸二氫鈉280 mL，混勻。

2. 器材

分光光度計、離心機、層析柱、細乳膠管、三角燒瓶 、刻度吸管 、量筒、試管、試管架、滴管、細玻璃棒、可調(diào)螺旋夾、坐標紙、鉛筆 、玻璃棉或海綿墊。

【實驗步驟】

1. 凝膠準備  稱取SephadexG-25 5 g或SephadexG-50 3 g，加磷酸鹽緩沖液50 mL，置于水中浸泡6小時（沸水浴中溶脹2小時)，用磷酸鹽緩沖液漂洗，去除漂浮的細小顆粒。

2. 裝柱  取直徑0.8~1.2 cm長25~30 cm的層析柱一支，將層析柱出口接上乳膠管，在柱底部填入一薄層玻璃棉或海綿墊。關(guān)住層析柱出口，用細玻璃棒將凝膠顆粒攪成懸液，順玻璃棒緩緩倒入層析柱中。當凝膠顆粒沉積約2 cm高時，打開出口，使緩沖液緩緩流出，同時繼續(xù)倒入凝膠懸液，掌握倒入速度，使其與緩沖液流出速度大體相同，直至凝膠床高度達18cm時為止。關(guān)閉層析柱出口，要求凝膠床要均勻，中間要連續(xù)，不得有氣泡或斷紋，表面要平整。如凝膠床表面不平整，可用細玻璃棒輕輕將凝膠床上部顆粒攪起，待其自然下沉，即可使表面平整。凝膠床表面要保留1cm高的緩沖液。

3. 樣品制備  將維生素B₂飽和水溶液和血紅蛋白溶液按1:1(體積比)混勻。

4. 加樣  打開層析柱出口，使緩沖液緩緩流出，當液面與凝膠床表面平齊時，關(guān)上出口。用吸管吸取待分離樣品溶液約0.5 mL，在接近凝膠床表面處沿層析柱內(nèi)壁緩緩加入。打開層析柱出口，使樣品溶液進入柱床。然后再用滴管沿層析柱內(nèi)壁加入磷酸鹽緩沖液，約1cm高。加樣不可過多，以免分離不完全。

5. 洗脫  將裝有細玻璃管的橡膠塞塞住層析柱入口，使細玻璃管的下端插入液面，但不可衛(wèi)生資格考試網(wǎng)接觸凝膠床表面。將裝有磷酸鹽緩沖液的下口瓶調(diào)好位置，使其略高于層析柱，將其流出管接在層析柱橡膠塞的細玻璃管上，保持密閉狀態(tài)。打開下口瓶出口，然后打開層析柱出口，使磷酸鹽緩沖液緩緩流出，保持4~6滴/min的流速。洗脫速度不可過快，以免區(qū)帶不清晰。

6. 收集  隨著層析的進行，凝膠床將出現(xiàn)兩條明顯的區(qū)帶，血紅蛋白區(qū)帶在下，維生素B₂區(qū)帶在上。當血紅蛋白區(qū)帶即將流出時，開始收集，每管收集約1 mL，直到流出液變?yōu)闊o色為止，約需收集5~6管；以同樣方法收集維生素B₂。

7. 測定  在540nm波長下，以磷酸鹽緩沖液調(diào)零，測定血紅蛋白和維生素B₂各管吸光度。

8. 結(jié)果及分析  以管號為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制洗脫曲線。分析實驗結(jié)果并說明原因。

【實驗注意事項】

1．在收集過程中，要保持流出液的流速穩(wěn)定。

2．加樣時，保持凝膠上平面不被攪動。

3．液面要始終高于凝膠上平面，否則會導致干柱。

【思考題】

1．小結(jié)己知的分離蛋白質(zhì)的生化方法有哪些?

2．鹽析法沉淀蛋白質(zhì)后，常用透析法脫去蛋白質(zhì)中鹽分，此外，你認為還可用什么方法脫鹽。為什么?