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緊密連接蛋白claudin-6通過p38 MAPK途徑誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡
緊密連接是內(nèi)皮和上皮細(xì)胞之間重要的連接形式，對(duì)于維持細(xì)胞極性和通透性方面發(fā)揮著重要作用。Claudins是構(gòu)成緊密連接的一種重要的跨膜蛋白。近年的研究表明，緊密連接參與了細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程調(diào)節(jié)了細(xì)胞的增殖和凋亡。Claudin蛋白通過胞漿區(qū)的羧基末端的PDZ結(jié)合序列與細(xì)胞骨架蛋白或信號(hào)蛋白相結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理活動(dòng)。Claudin-6為claudin蛋白家族成員之一。
我們?cè)谇捌诠ぷ髦邪l(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比穩(wěn)定過表達(dá)claudin-6的MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，且流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞存在著一定的死亡，為證實(shí)這種死亡部分是由凋亡造成的，我們檢測(cè)了轉(zhuǎn)染claudin-6前后細(xì)胞的凋亡及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況，本論文初步探討了claudin-6在MCF-7細(xì)胞凋亡中的作用。
1 材料和方法
1.1 材料 穩(wěn)定過表達(dá)claudin-6的MCF-7細(xì)胞為本室保存。原位檢測(cè)細(xì)胞凋亡的TUNEL試劑盒和DAPI染料購(gòu)自德國(guó)Roche公司。Annexin- /PI apoptosis Ⅴ 試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。 TRIZOL reagent和RT-PCR試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品。 Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清和G418均為Gibco 公司產(chǎn)品�？谷肆姿峄痯38抗體購(gòu)自Cell SignalingTechnology。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑SB203580購(gòu)自Calbiochem公司。
1.2 方法
1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組：以下實(shí)驗(yàn)均分為三組，對(duì)照組（control)為未轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞；空載組（vector)為轉(zhuǎn)染空載體的MCF-7細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組為穩(wěn)定表達(dá)claudin-6的MCF-7細(xì)胞組（C1-C2) 。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次。
1.2.2 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按TUNEL試劑盒說明進(jìn)行：取細(xì)胞爬片，用胃蛋白酶37℃消化 60min；PBS 沖洗，加 50μl 的0.3％H2O2 甲醇溶液，PBS沖洗；加 25μl 的 TUNEL 反應(yīng)溶液，37℃孵育60min；PBS 沖洗，加 25μl 的辣根過氧化物酶抗體，濕盒中 37℃孵育60min；PBS 沖洗，加一滴新鮮配制的DAB 室溫孵育10min，PBS 沖洗；蘇木精復(fù)染核，酒精脫水，干燥；中性樹膠封片，光鏡觀察，細(xì)胞核棕色者為陽性。
1.2.3 Annexin- /PI Ⅴ 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按試劑盒說明書操作：常規(guī)胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至 5×105-1×106個(gè)/ml。取 1ml細(xì)胞 1000rpm，4℃離心 10min 后棄上清。加入1ml冷的PBS，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮， 1000rpm， 4℃離心 10min 后棄上清。將細(xì)胞重懸于200ul Binding Buffer，加入10ul AnnexinV-FITC和 5ul PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng) 15min 或 4℃反應(yīng)30min后將染色后的細(xì)胞懸液加入 96 孔板中，在 1h 內(nèi)用熒光顯微鏡檢測(cè)。陽性結(jié)果判斷：綠色為早期凋亡細(xì)胞，紅色為晚期凋亡細(xì)胞。
