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2.2 1mmol/L Lig對(duì)Glu誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元保護(hù)作用的形態(tài)學(xué)變化 Glu作用于細(xì)胞20min，繼續(xù)培養(yǎng)12h后顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞變圓，胞體腫脹，細(xì)胞失去原有形態(tài)，突起淡化、減少或消失。細(xì)胞內(nèi)、外出現(xiàn)較多的黑色顆粒，貼壁不牢，折光性下降(圖2)。 Lig保護(hù)組與Glu損傷組相比，神經(jīng)元的胞體較完整，大部分細(xì)胞的存在少量的突起。細(xì)胞突起存在少量的聯(lián)系，突起的數(shù)量較正常組減少。
2.3 AChE免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果 鏡下可見棕色顆粒為陽性反應(yīng)物，免疫組化陰性對(duì)照組未見此棕色顆粒。陽性神經(jīng)元呈現(xiàn)三角形、橢圓形或圓形，突起明顯。陽性反應(yīng)物主要分布在細(xì)胞胞漿中，細(xì)胞核及突起著色較淡。與正常對(duì)照組和Lig保護(hù)組相比較，Glu損傷組細(xì)胞明顯淺淡(圖3)。對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行半定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常組細(xì)胞的平均灰度值為148.6±9.88，Glu損傷組細(xì)胞的平均灰度值為171.5±6.87，Lig保護(hù)組平均灰度值為151.0±12.37。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明正常組灰度值低于Glu損傷組(P<0.01)，Lig保護(hù)組灰度值低于Glu損傷組(P<0.05)，正常組和保護(hù)組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。表1 Lig對(duì)Glu損傷培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用
2.4 Lig對(duì)Glu損傷的海馬神經(jīng)元活性和LDH的影響 MTT法檢測(cè)各組海馬神經(jīng)元活性(表1)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Glu損傷后細(xì)胞活性顯著下降(P<0.001); Lig保護(hù)組與Glu損傷組相比細(xì)胞活性明顯升高(P<0.05)。Glu損傷后12h，分別檢測(cè)各孔培養(yǎng)上清中LDH的活力(表1)。結(jié)果顯示Glu損傷可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元LDH釋放顯著增加，表現(xiàn)為培養(yǎng)上清LDH活力顯著增加(P<0.01)，1mmol/L 的Lig可顯著抑制Glu損傷神經(jīng)元LDH的釋放(P<0.05)。
3 討 論
Lig是中藥川芎的有效成分，在治療缺血性腦血管病等方面療效肯定，而且對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷有較好的修復(fù)作用。研究表明Lig可明顯抑制皮質(zhì)和海馬NOS陽性細(xì)胞增多，與NOS拮抗劑LNAME(10mg/kg)的作用相似;腦缺血時(shí)使用鹽酸Lig注射液可顯著降低細(xì)胞外興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)Glu和天冬氨酸(Asp)的濃度[4]。Glu是哺乳動(dòng)物腦內(nèi)含量最高的興奮性氨基酸之一。許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病可引起Glu的過度釋放,從而產(chǎn)生嚴(yán)重的神經(jīng)興奮毒性，引起神經(jīng)元損傷或死亡。海馬是腦內(nèi)對(duì)缺血、缺氧最為敏感的部位之一。與皮層神經(jīng)元相比，海馬神經(jīng)元易純化而且含有高密度的Glu受體[5]。原代培養(yǎng)細(xì)胞比細(xì)胞株更接近生理狀態(tài)的生物學(xué)特性，選用其探討藥物的作用機(jī)制具有實(shí)際意義。因此，本研究選用原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元，模擬體內(nèi)高濃度Glu條件，研究Lig對(duì)抗Glu興奮性毒性作用，以探討Lig保護(hù)神經(jīng)元損傷的可能機(jī)制醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站payment-defi.com。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Lig可以保護(hù)Glu誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，Lig保護(hù)組神經(jīng)元的胞體接近正常培養(yǎng)狀態(tài)下的細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞貼壁情況較Glu損傷組明顯改善。同時(shí)，MTT結(jié)果表明，Lig保護(hù)組細(xì)胞活性明顯得到提高，降低Glu引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡率。LDH漏出率實(shí)驗(yàn)表明，Glu能引起神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)大量LDH的釋放，LDH釋放率可反映細(xì)胞膜的通透性及完整性[6]，而Lig能明顯降低神經(jīng)細(xì)胞LDH的釋放，說明Lig能很好的保護(hù)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。乙酰膽堿是中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，海馬內(nèi)有豐富的膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)存在，其纖維主要來源于隔區(qū)的內(nèi)側(cè)隔核和斜角帶垂直支的膽堿能神經(jīng)元。膽堿酯酶(AChE)的基本作用是快速水解神經(jīng)終末的乙酰膽堿，在哺乳動(dòng)物皮質(zhì)有AChE的表達(dá)，海馬中非膽堿能神經(jīng)元也有表達(dá)[78]。研究發(fā)現(xiàn)，在早期培養(yǎng)胚胎海馬神經(jīng)元中可大量表達(dá)AChE，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，其表達(dá)量逐漸下降。AChE對(duì)發(fā)育過程中海馬Glu能神經(jīng)元樹突的形成至關(guān)重要[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Glu的細(xì)胞毒性抑制了細(xì)胞合成AChE，表現(xiàn)為細(xì)胞的突起減少、突起與突起之間的聯(lián)系減少、相應(yīng)的突觸結(jié)構(gòu)減少，結(jié)果影響了神經(jīng)元的生長。相反，Lig明顯可以對(duì)抗Glu的毒性作用，促進(jìn)細(xì)胞AchE的合成，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育成熟。當(dāng)然，Lig保護(hù)Glu介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用的詳細(xì)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
