支氣管哮喘大鼠淋巴液中淋巴細胞線粒體跨膜電位變化及地塞米松對其干預的影響

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：清潔級SD大鼠90只(山東綠葉制藥廠動物中心)，雌雄各半，體重在200～220 g，月齡2～3個月。隨機分為對照組(30只)、哮喘組(30只)，治療組(30只)。

1.1.2 主要試劑和儀器：卵白蛋白(OVA, GradeV、II，美國Sigma公司)。RH��123(美國Sigma公司)，淋巴細胞分離液(中國科學院天津試劑廠)，兔抗鼠Fas、FasL檢測試劑盒(武漢博士德生物有限公司)，SABC試劑盒(武漢博士德生物有限公司)，JSC�睴K型單雙通用水電分離式超聲波霧化器(遼寧省鞍山市電子醫(yī)療儀器廠)，EPICS XL流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)，IMAGE�睵RO PLUS圖像分析系統(tǒng)( 美國Media Cybernetics公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠哮喘模型的建立:參照文獻[3]的方法。實驗組大鼠分別于實驗第1天、第8天用新鮮配制的OVA( GradeV) 1 mg + 氫氧化鋁200 mg + 生理鹽水1 ml 混懸液在大鼠兩腹股溝、腹部、前足跖4 個部位做皮下注射(每點0.2 ml),同時腹腔注射0.2 ml。于第15天,將大鼠置于20 cm×20 cm×15 cm大小的密閉容器中,用1%OVA 進行霧化吸入激發(fā),每次霧化30 min ,連續(xù)7 d。對照組大鼠以等量的生理鹽水代替卵白蛋白，同法、同量、同期進行致敏和激發(fā)，治療組霧化吸入前30 min給予地塞米松2 mg/kg(生理鹽水稀釋為0.4 mg/ml)，每只每天腹腔注射。對照組、哮喘組、治療組大鼠分別于激發(fā)后2、6、12、24、48 h 收集取淋巴液、BALF和血液分離淋巴細胞進行檢測醫(yī).學全.在.線網站payment-defi.com。

1.2.2 大鼠淋巴液的采集：大鼠仰臥位，4%水合氯醛0.1 ml/kg腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒。于劍突恥骨聯合連線上2/3作腹部正中切口，將腸內容物移出腹腔，用溫鹽水紗布包裹。在右腎動脈水平，腸系膜上動脈處尋找腸系膜淋巴干。用留置針插入淋巴管，收集0.5 ml淋巴液。常規(guī)分離淋巴液中淋巴細胞，調整細胞濃度為1×106/ml。

1.2.3 大鼠BALF、血液的收集：打開胸腔，充分暴露頸部,分離氣管, 0號絲線結扎右主支氣管。切開氣管，行氣管插管，固定，經氣管行左肺支氣管肺泡灌洗。用5 ml冷生理鹽水分3次注入，約30 s后回收BALF，回收率高于80%。收集4 ml左右灌洗液4℃ 1 000 r/min，離心10 min，將沉淀細胞用1 ml PBS懸浮后，用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，調整細胞濃度為1×106/ml。心臟穿刺取血，收集4 ml左右置于肝素離心管內，常規(guī)分離液分離淋巴細胞，調整細胞濃度為1×106/ml。

1.2.4 流式細胞儀檢測淋巴細胞線粒體跨膜電位：分離的淋巴細胞用PBS清洗2次,加入1ml的終濃度為1 μg/ml Rhoda�瞞ine��123放入37 ℃孵箱里靜置培養(yǎng)45 min;PBS清洗2次,傾去原有液體;250 μl PBS重懸,緩慢加入-20 ℃乙醇750 μl;流式細胞儀檢測(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm)。

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