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亞砷酸(主要成分為As2O3)購(gòu)自哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)有限公司;TUNEL凋亡試劑盒購(gòu)自德國(guó)Roche公司;兔抗人Fas和FasL多克隆抗體均為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;人胃癌SGC7901細(xì)胞購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
1.2 人胃癌裸鼠移植瘤模型的建立和分組
30只BALB/C-nu/nu裸鼠，雄性，5周齡，體重19～21g，在SPF條件下飼養(yǎng)。在無(wú)菌條件下，每只裸鼠于右后肢背部皮下注射4×106個(gè)人胃癌SGC7901細(xì)胞(0.2mL)，接種10d后，裸鼠均形成瘤節(jié)。隨即將30只裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組及As2O3低、高劑量治療組3組。As2O3低劑量組和高劑量組分別按2.5mg/kg和5mg/kg劑量給予As2O3腹腔注射治療;對(duì)照組給予等體積生理鹽水。連續(xù)給藥10d。
1.3 抑瘤率的計(jì)算
于給藥第0、6、11天分別測(cè)量瘤塊的長(zhǎng)徑(a)、短徑(b)，瘤塊體積(cm3)=1/2ab2，抑瘤率=(1-治療組瘤塊平均體積/對(duì)照組瘤塊平均體積)×100%。同時(shí)留取各組的肝、腎組織。
1.4 組織標(biāo)本的制備和電鏡觀察
治療結(jié)束次日，每組取2只裸鼠，每只裸鼠腹腔注射1g/L戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，用刮胡刀片從每個(gè)瘤塊中游離出體積約1mm3的瘤組織，放入25g/L戊二醛中固定，供電鏡用。所有裸鼠取出瘤組織，放入40g/L多聚甲醛溶液中固定，制備冰凍切片供TUNEL法檢測(cè)凋亡用，制備石蠟切片供HE染色或免疫組化檢測(cè)Fas/FasL用;取出裸鼠的肝、腎放入40g/L多聚甲醛溶液中固定，制備石蠟切片供HE染色用。
按常規(guī)透射電鏡制樣方法固定、包埋和染色，于H-600型透射電鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況并拍照。
1.5 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況
嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行。結(jié)果判定：Leica激光顯微鏡下、515～565nm綠光觀察，每個(gè)樣本在凋亡細(xì)胞較集中的區(qū)域(凋亡熱區(qū))取10個(gè)400倍視野，用Leica Confocal軟件測(cè)量其熒光強(qiáng)度，該10個(gè)視野熒光強(qiáng)度的平均值分別為每個(gè)樣本的熒光強(qiáng)度值。
1.6 免疫組化法檢測(cè)Fas、FasL蛋白的表達(dá)
按SP免疫組化染色試劑盒說(shuō)明書操作。結(jié)果判定：每個(gè)樣本在Fas/FasL高表達(dá)區(qū)域取10個(gè)400倍視野，用Leica圖像信號(hào)采集與分析系統(tǒng)測(cè)量其灰度，該10個(gè)視野灰度的平均值分別為每個(gè)樣本的灰度值。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多樣本均數(shù)比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析，各組均數(shù)間兩兩比較用Student-Newman-Kewls法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義醫(yī).學(xué)全.在.線payment-defi.com。
2 結(jié) 果
2.1 裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)情況及As2O3的抑瘤率
30只裸鼠在接種胃癌細(xì)胞10d后均形成結(jié)節(jié)，全部成瘤。給藥前3組間瘤塊的平均體積沒(méi)有顯著性差異(P>0.05);給藥第6天3組間瘤塊的平均體積仍然沒(méi)有顯著性差異(P>0.05);給藥第11天(治療結(jié)束次日)兩個(gè)治療組瘤塊的平均體積均顯著小于對(duì)照組(P<0.05)，且高劑量治療組顯著小于低劑量治療組(P<0.05，表1);用瘤重來(lái)計(jì)算得到同樣的結(jié)果。治療組與對(duì)照組相比，裸鼠的肝、腎組織無(wú)明顯病理?yè)p害。表1 As2O3對(duì)裸鼠皮下移植瘤的抑制作用(略)與對(duì)照組比較，^P<0.05;與As2O3低劑量組比較，△P<0.05。
2.2 透射電鏡下腫瘤細(xì)胞的凋亡情況
對(duì)照組呈典型的瘤細(xì)胞表現(xiàn)，瘤細(xì)胞大小不一，形態(tài)不規(guī)則，胞核較大，多核仁，核仁大小不一，核仁有不居中現(xiàn)象甚至邊集;凋亡細(xì)胞極少見(jiàn)。低劑量治療組可見(jiàn)凋亡細(xì)胞，但比高劑量治療組少，且典型的“凋亡小體”極少見(jiàn);高劑量組可見(jiàn)較多的凋亡細(xì)胞，染色質(zhì)濃染邊集，有的正在或已經(jīng)被周圍的細(xì)胞所吞噬，凋亡細(xì)胞集中的區(qū)域可見(jiàn)典型的“凋亡小體”。治療組可見(jiàn)典型的壞死細(xì)胞(圖1)。
2.3 TUNEL法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡情況
激光共聚焦顯微鏡下(400倍)，被熒光著色的是凋亡細(xì)胞。治療組尤其是高劑量組凋亡細(xì)胞較多，對(duì)照組凋亡細(xì)胞較少，且凋亡細(xì)胞有集中分布現(xiàn)象(圖2)。采用LeiCa Confocal軟件定量分析3組腫瘤凋亡細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示，對(duì)照組的熒光強(qiáng)度為12.49±3.22，2.5mg/kg As2O3組和5mg/kg As2O3組的熒光強(qiáng)度分別為25.74±3.82和85.39±8.92，對(duì)照組分別與治療組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。表2 As2O3治療組和對(duì)照組Fas、FasL表達(dá)的比較(略)與對(duì)照組比較，^P<0.05;灰度值越低說(shuō)明表達(dá)越高。
