| 公開(公告)號 | CN1884557A |
| 公開(公告)日 | 2006.12.27 |
| 申請(專利)號 | CN200610052151.7 |
| 申請日期 | 2006.06.27 |
| 專利名稱 | 脂質(zhì)體包裹弓形蟲pGRA4真核表達質(zhì)粒的方法及用途 |
| 主分類號 | C12N15/88(2006.01)I |
| 分類號 | C12N15/88(2006.01)I;C12N15/79(2006.01)I;C12N15/30(2006.01)I;A61K48/00(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 浙江大學 |
| 發(fā)明(設計)人 | 陳 睿;王金福 |
| 地址 | 310027浙江省杭州市西湖區(qū)浙大路38號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構(gòu) | 杭州求是專利事務所有限公司 |
| 代理人 | 張法高;趙杭麗 |
| 國省代碼 | 浙江;33 |
| 主權(quán)項 | 一種脂質(zhì)體包裹弓形蟲pGRA4真核表達質(zhì)粒的方法，通過以下方案實現(xiàn)： (一)構(gòu)建pcDNA3-致密顆粒蛋白4真核表達質(zhì)粒： 從復蘇的弓形蟲RH株中提取DNA，并通過聚合酶鏈反應方法合成致密顆粒蛋白4基因片段后，分別用華美生物工程公司的KpnI和EcoRI雙酶切經(jīng)凝膠純化的致密顆粒蛋白4基因片段和pcDNA3載體，經(jīng)T4DNA連接酶處理后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α菌株，挑取轉(zhuǎn)化菌單菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，堿裂解法收集大量pcDNA3-致密顆粒蛋白4真核表達質(zhì)粒，聚乙二醇沉淀法純化pcDNA3-致密顆粒蛋白4真核表達質(zhì)粒DNA；致密顆粒蛋白4基因擴增引物：5`-CGC GGG TAC CAT GCA GGG CAC TTG GTT TTC-3`和5`-CGC GGA ATTCTC ACT CTT TGC GCA TTC TTT-3`， (二)通過改進的脫水-再水化法構(gòu)建脂質(zhì)體，并包裹弓形蟲pcDNA3-致密顆粒蛋白4真核表達質(zhì)粒： 將磷脂酰膽堿、1，2-二油酰氧丙基-N，N，N-三甲基溴化銨、二油酰磷脂酰乙醇胺按16∶8∶4混合，溶于氯仿，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至氯仿完全蒸干后，加入1ml含100mgpcDNA3-致密顆粒蛋白4真核表達質(zhì)粒的磷酸鹽緩沖液，4℃振蕩3小時使之完全混溶，冷凍干燥24小時后可見一塊狀白色多孔固體，使用時再加入1ml含50mg pcDNA3-致密顆粒蛋白4真核表達質(zhì)粒的磷酸鹽緩沖液水化。 |
| 摘要 | 本發(fā)明提供一種脂質(zhì)體包裹弓形蟲pGRA4真核表達質(zhì)粒的方法，采用改進的脫水-再水化法制備脂質(zhì)體，即在冷凍干燥過程之前和之后分別加入需包裹的真核表達質(zhì)粒，可提高對真核表達質(zhì)粒的包裹率，并且在使用前以凍干方式保存脂質(zhì)體，使用時再水化，可提高構(gòu)建脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，減少構(gòu)建的脂質(zhì)體不穩(wěn)定對包裹造成的影響。本發(fā)明提供的脂質(zhì)體包裹弓形蟲pGRA4真核表達質(zhì)粒，有效的提高了小鼠的細胞免疫水平，可在制備提高動物免疫保護藥物中應用。 |
| 國際公布 |
