| 公開(公告)號 | CN1840707A |
| 公開(公告)日 | 2006.10.04 |
| 申請(專利)號 | CN200610013091.8 |
| 申請日期 | 2006.01.23 |
| 專利名稱 | 基于免疫耐受樹突細胞篩選免疫耐受相關(guān)疾病的基因RGS1的方法 |
| 主分類號 | C12Q1/68(2006.01)I |
| 分類號 | C12Q1/68(2006.01)I;C12Q1/04(2006.01)I;C12N5/08(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 南開大學 |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 楊榮存;劉 昱;R.盧登;W.如適;張 園;張灼寒 |
| 地址 | 300071天津市衛(wèi)津路94號南開大學醫(yī)學院 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構(gòu) | 天津市學苑有限責任專利代理事務(wù)所 |
| 代理人 | 趙尊生 |
| 國省代碼 | 天津;12 |
| 主權(quán)項 | 一種基于免疫耐受樹突細胞篩選免疫耐受相關(guān)疾病的基因RGS1的方法，，其特征在于包括下述步驟： (1)免疫耐受樹突細胞的制備和鑒定 1)取4-6周小鼠的骨髓細胞，用水溶解去除紅細胞后，在1000單位GM-CSF，10％FCSRPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃下培養(yǎng)4天的骨髓起源的樹突細胞作為未成熟的樹突細胞； 2)未成熟的樹突細胞用生理鹽水洗三次，分別與鼠卵巢癌腫瘤細胞，已照射卵巢癌細胞或卵巢癌細胞上清液共同培養(yǎng)9天； 3)用2μlFITC螢光素標記的CD80抗體染鼠卵巢腫瘤細胞與樹突細胞，鼠卵巢腫瘤細胞與樹突細胞混和培養(yǎng)在10％FCSRPMI1640培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)9天，用流式細胞儀分離樹突細胞，得免疫耐受樹突細胞； 4)首先對免疫耐受樹突細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)進行了觀察，觀察腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細胞的形態(tài)與結(jié)構(gòu)； 5)腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細胞用生理鹽水洗三次后，分別加2μlFITC螢光素標記的抗CD40、CD80和CD86抗體染色，流式細胞儀分析，分析免疫耐受樹突細胞刺激分子的表達； 6)用類乳頭瘤病毒質(zhì)粒(VLP)免疫鼠引導的特異性T細胞作為靶細胞，腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細胞與對照樹突細胞在裝載類乳頭瘤病毒質(zhì)粒(VLP)后作為刺激細胞；共同培養(yǎng)48小時，取上清液，通過酶聯(lián)免疫檢測試劑盒分析上清液中的IFN-γ含量； (2)免疫耐受樹突細胞內(nèi)免疫耐受基因的篩選 1)用Trizol試劑從腫瘤相關(guān)性樹突細胞提取總RNA； 2)對腫瘤相關(guān)性樹突細胞總RNA通過基因芯片進行分析，所用基因芯片是AffymetrixMouseU74GeneChipseries(U74A，U74B和U74C)，由美國約翰霍普金斯大學醫(yī)學院基因組研究室分析： 1、用寡核苷酸和dT作為引物以及SuperScriptchoice合成單股cDNA； 2、然后合成雙股cDNA，雙股cDNA通過苯酚-氯仿(1∶1體積)抽提后，利用BioArrayRNAhighyieldTranscriptlabeling試劑盒，通過體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生Biomylatedanti-sensecRNA； 3、處理過的cRNA在45℃下與Affymetrix基因組基因芯片雜交，用AffymetrixFluidicsStation400洗染基因芯片除去未雜交的cRNA，然后用streptavidin-PE結(jié)合BiotimylatedcRNA，再與羊抗-streptavidinAb孵育；用Hewlett-PackardG2500GeneArray檢測熒光強度，用MicroArraySuite5.0軟件對每個基因芯片進行圖像分析； 4、采用AgilentBioanalyzer(PaloAlto，CA)與“Labonachip”(芯片實驗室)進行證實所有樣本有著類似的rRNA比率， 5、根據(jù)美國基因庫提供生物信息，對在腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細胞基因芯片分析中明顯上調(diào)的基因或明顯下調(diào)的基因結(jié)合基因庫提供生物信息進行分析； 6、RGS1基因在腫瘤相關(guān)的樹突細胞的高水平表達通過半定量PCR和定量PCR進一步評價，根據(jù)基因庫提供生物信息，找出在腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細胞中明顯上調(diào)的RGS1基因序列；序列： 5’atgccaggaatgttcttttctgctagcccaaaggattcgaaagaacacagccattctctt ctagacgacaaaaagcagaaaaaaaggccaaagacttttggaatggacgtgaaaacatac ctgagatcgatgatcccacatctggaatctgggatgaaatcggccaagtccaaagacata ctttctgctgaagaagtaatgcagtggtctcagtctctggaaaaactccttgccaaccag acaggtcaaaatgtctttggaagatttctaaagtctgaattcagtgaggaaaatattgaa ttctggttggcttgtgaggactataagaaaacagagactgatcttttgcataacaaagca gagaatatatacaaagcatttgtgcattcagatgctgtgaaacaaatcaatattgacttc catactcgagaatcgacagccaagaagattaaaacaccaactcccacatcttttgatgaa gcacaaaaagtcatatattcactcatggaaaaagattcttatcccaggttcctgaaatca aatatttacttaaatcttctaaatgaccttcaggcaaatactttaaagtga3’ 設(shè)計RGS1基因引物：5’atgccaggaatgttcttttctgctag-3’和3’ctttaaagtatttgcctgaaggtc-5’，用Invitrogen提供的RT-PCR試劑盒進行分析，用SybrGreenI檢測模式通過定量PCR，用TAKARA公司提供的SYBRgreenI螢光染料測定RGS1的轉(zhuǎn)錄水平； (3)克隆RGS1基因 從腫瘤相關(guān)性樹突細胞用Trizol試劑提取總RNA，用RGS1引物：5’atgccaggaatgttcttttctgctag-3’和3’ctttaaagtatttgcctgaaggtc-5’，通過Invitrogen公司提供的RT-PCR試劑盒，按照該公司提供的實驗步驟擴增RGS1基因，通過Invitrogen膠提取試劑盒提取擴增的RGS1基因片段，然后通過Invitrogen公司提供的pCDNA3.1His/V5ToPo載體，根據(jù)該公司提供的實驗步驟將RGS1基因克隆到pCDNA3.1His/V5ToPo載體，最后，通過測序確定上述列出的RGS1序列； (4)對篩選的腫瘤相關(guān)免疫耐受相關(guān)基因功能進一步鑒定： 1)用載有免疫耐受基因RGS1載體與pNF-KappaB-Seap報告基因通過lipofectin2000(Invitrogen)共同轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞，然后用1μg/mlLPS或25μg/mlPolyI:C刺激，24小時后吸取上清液，上清液用，GreatEscApeSEAPChernilumineScence檢測試劑盒分析上清液的化學發(fā)光強度； 2)腫瘤相關(guān)免疫耐受基因RGS1轉(zhuǎn)染的RAW264.7，在600μg/mlG418選擇條件下，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系，染色后通過流式細胞儀分析這些穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞表面刺激分子CD40、CD80和CD86及其它共刺激分子的表達；同時，分析這 |
| 摘要 | 本發(fā)明提供了基于免疫耐受樹突細胞篩選免疫耐受相關(guān)疾病基因RGS1的方法。通過體外培養(yǎng)建立了制備人免疫耐受樹突細胞，RGS1基因在免疫耐受樹突細胞中的表達明顯升高。當RGS1基因或靶向這些基因的siRNA轉(zhuǎn)染單核細胞系，影響轉(zhuǎn)錄因素的激活，細胞因子的產(chǎn)生和共刺激分子的表達；重要的是轉(zhuǎn)染免疫調(diào)節(jié)細胞樹突細胞后能夠發(fā)揮特有的免疫調(diào)節(jié)功能，引導免疫耐受。這些基因在免疫相關(guān)性疾病如抗移植排斥反應(yīng)、腫瘤、炎癥、自身免疫性疾病的治療方面有著巨大的潛在應(yīng)用價值。 |
| 國際公布 |
