| 公開(公告)號 | CN1322128C |
| 公開(公告)日 | 2007.06.20 |
| 申請(專利)號 | CN200410006363.2 |
| 申請日期 | 2004.03.01 |
| 專利名稱 | 嗜肺軍團菌（Legionella pneumophila)MIP基因克隆、重組、表達和蛋白純化方法 |
| 主分類號 | C12N15/31(2006.01)I |
| 分類號 | C12N15/31(2006.01)I;C12N15/63(2006.01)I;C12N15/70(2006.01)I;C12P21/00(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 天津瑞愛金生物科技有限公司 |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 楊建國;王金良;李曉眠;張 楷 |
| 地址 | 300080天津市華苑產(chǎn)業(yè)區(qū)二緯路6號F座7門301室 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構(gòu) | 天津市宗欣專利商標(biāo)代理有限公司 |
| 代理人 | 董光仁 |
| 國省代碼 | 天津;12 |
| 主權(quán)項 | 一種嗜肺軍團菌MIP基因克隆重組表達方法，其特征在于包括以下步驟：(1)、克隆嗜肺軍團菌MIP的基因，用PCR法擴增嗜肺軍團菌MIP的基因，所引用的引物為：引物1： 5’ AAGGATAAGTTGTCTTATAG，引物2： 5’ AAGCTTCTGTCCATCCTGGGA；(2)、將上述擴增的嗜肺軍團菌MIP基因與克隆載體連接，構(gòu)建嗜肺軍團菌MIP克隆質(zhì)粒；(3)、將上述嗜肺軍團菌MIP克隆質(zhì)粒亞克隆進表達載體，再將連接后的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染大腸桿菌；(4)、表達嗜肺軍團菌MIP蛋白：a、將上述帶有嗜肺軍團菌MIP基因表達載體的大腸桿菌接種含有抗生素的LB培養(yǎng)基板，將板放置37℃溫箱過夜培養(yǎng)；b、從板上選一個菌落，接種在含有抗生素的LB培養(yǎng)基瓶內(nèi)，在37℃搖箱內(nèi)培養(yǎng)，測菌液A650OD值為0.6-0.8時停止培養(yǎng)；c、向菌液內(nèi)加IPTG，使其終濃度為0.5mM，繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時；d、收獲細(xì)菌；(5)、純化嗜肺軍團菌MIP蛋白：a、將上述細(xì)菌沉淀用pH8.0的磷酸鹽緩沖液洗一次，離心后，再用pH8.0的磷酸鹽緩沖液懸浮沉淀；b、超聲裂解細(xì)菌，離心，將沉淀加8M尿素懸浮，離心，取上清液；c、純化用離子交換和Ni-NTG-His柱親和層析進行純化。 |
| 摘要 | 本發(fā)明涉及一種嗜肺軍團菌Legionella pneumophila macrophageinfectivity potentiator MIP基因的克隆、重組、表達、純化方法與專用引物，以及MIP蛋白及其類似物、衍生物在軍團菌感染病人的臨床診斷和治療方面的應(yīng)用。本方法將獲得的嗜肺軍團菌(Legionalla Neomaphalla)MIP基因組DNA，用PCR方法獲得MIP基因，并將該基因重組后克隆到大腸桿菌表達載體中，誘導(dǎo)表達后提取MIP蛋白，進而應(yīng)用親和層析方法得到高純度的蛋白，為臨床進一步診斷嗜肺軍團菌感染應(yīng)用于檢測嗜肺軍團菌抗原和抗體。 |
| 國際公布 |
