| 公開(公告)號 | CN1261566C |
| 公開(公告)日 | 2006.06.28 |
| 申請(專利)號 | CN200410005171.X |
| 申請日期 | 2004.02.11 |
| 專利名稱 | 非受體型酪氨酸蛋白激酶Syk的制備方法 |
| 主分類號 | C12N9/12(2006.01)I |
| 分類號 | C12N9/12(2006.01)I;C12N15/54(2006.01)I;C12N15/63(2006.01)I;C07K16/06(2006.01)I;C07K16/40(2006.01)I;A61K38/45(2006.01)I;C12Q1/68(2006.01)I;G01N33/53(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權 | |
| 申請(專利權)人 | 單保恩 |
| 發(fā)明(設計)人 | 馬 洪;單保恩 |
| 地址 | 050011河北省石家莊市健康路12號河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院科研中心 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構 | 石家莊新世紀專利商標事務所有限公司 |
| 代理人 | 董金國 |
| 國省代碼 | 河北;13 |
| 主權項 | 非受體型酪氨酸蛋白激酶Syk的制備方法，其特征在于它包括以下工藝步驟：A、細胞株及細胞培養(yǎng)：Sf21細胞株應用Grace′s培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，將細胞調整到1×109/L的密度，用培養(yǎng)瓶于恒溫搖床在轉速為80-100轉/分、溫度26-28℃條件下進行培養(yǎng)，經(jīng)胎盼藍染色檢測活細胞百分率應為95％-100％；B、應用Bac-to-Bac方法進行制備重組Syk基因的桿狀病毒；C、純化baconidSykDNA：應用脂質體介導技術，將轉染Syk基因的Sf21細胞于28℃培養(yǎng)4-6天，用Gibco-BRL公司提供的cellfectin試劑進行選擇培養(yǎng)，收集細胞制備SykDNA；應用噬菌體純化法純化病毒顆粒，經(jīng)培養(yǎng)一些孔形成噬菌斑，將這些陽性培養(yǎng)孔細胞經(jīng)SDS-PAGE檢測Mr為72×103蛋白條帶的存在；D、Sf21細胞的大量制備：于培養(yǎng)瓶中加入1L呈對數(shù)生長期的Sf21細胞懸液，每毫升細胞懸液中的含Sf21細胞1.0-1.2×106個，加入病毒貯存液，其病毒濃度約為2.5×108pfu/mL，于恒溫搖床在80-100轉/分、溫度為28℃條件下培養(yǎng)48小時進行病毒感染和細胞增殖，其病毒感染率約為6；E、Syk的分離、純化：收集細胞懸液進行低速離心，將細胞數(shù)量為2.5×109的細胞沉淀物與細胞裂解液共同培養(yǎng)30分鐘，于冰浴中用超聲波破碎儀振蕩裂解3次，每次30秒，將細胞裂解液于4℃超速離心，收集上清液并過濾，將濾液加入由Sigma生產(chǎn)、規(guī)格為2.5×10cm的活化的Yellow-3層析柱，用兩倍體積的緩沖液和1倍體積的含有200mmol/LNaCl的緩沖液沖洗層析柱。Syk蛋白用3.5倍體積的含200mmol/L-1mol/LNaCl的緩沖液洗脫。 |
| 摘要 | 本發(fā)明屬于基因治療領域，特別是指一種輔助乳腺癌診斷、治療方案制定及估計預后的相關基因-非受體型酪氨酸蛋白激酶Syk的制備方法。主要包括細胞株及細胞培養(yǎng)、應用Bac-to-Bac方法進行制備重組Syk基因的桿狀病毒、純化baconid Syk DNA、Sf21細胞的大量制備、Syk的分離、純化等工藝步驟。本發(fā)明解決了乳腺癌的早期診斷、治療方案選擇、病情復發(fā)和轉移監(jiān)測、療效評價和預后估價以及群體隨訪觀察和普查等方面的問題，具有工藝設計合理，可輔助乳腺癌診斷、治療方案制定及估計預后等優(yōu)點。 |
| 國際公布 |
