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總狀共頭霉代謝物殺線蟲活性組分的分離純化方法

公開(公告)號 CN1233835C  
公開(公告)日 2005.12.28  
申請(專利)號 CN03130528.8  
申請日期 2003.07.31  
專利名稱 總狀共頭霉代謝物殺線蟲活性組分的分離純化方法  
主分類號 C12P7/44  
分類號 C12P7/44;A01N37/00;//C12P7/44,C12R1∶645  
分案原申請?zhí)?  
優(yōu)先權(quán)  
申請(專利權(quán))人 天津師范大學(xué)  
發(fā)明(設(shè)計(jì))人 孫建華;杜連祥;杜 淼;王海寬;王瑾玲;趙小軍;張 穎;路福平;李 喆  
地址 300074天津市河西區(qū)衛(wèi)津路241號天津師范大學(xué)  
頒證日  
國際申請  
進(jìn)入國家日期  
專利代理機(jī)構(gòu) 天津市學(xué)苑有限責(zé)任專利代理事務(wù)所  
代理人 李 明  
國省代碼 天津;12  
主權(quán)項(xiàng) 總狀共頭霉代謝物殺線蟲活性組分的分離純化方法,其特征是將總狀共頭霉代謝產(chǎn)物的發(fā)酵原液,采用旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)、重結(jié)晶、弱堿性陰離子交換樹脂分離方法,經(jīng)過紫外、紅外光譜及X射線單晶衍射和高效液相色譜進(jìn)行分析鑒定,確定了殺蟲活性組分中含有有機(jī)酸,即為乙二酸,還有蘋果酸、石酸和乳酸;經(jīng)濃縮重結(jié)晶技術(shù)得到含兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸及8配位鉀的乙二酸配合物;總狀共頭霉代謝產(chǎn)物殺線蟲活性物質(zhì)的分離純化工藝:發(fā)酵液經(jīng)真空抽濾得到發(fā)酵濾液,此后,將部分濾液即發(fā)酵原液通過離子交換柱進(jìn)行層析分離,然后再通過高效液相色譜對分離組分進(jìn)行檢測鑒定;另一方面將剩余濾液即發(fā)酵原液經(jīng)旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā),獲得濃縮液,再將濃縮液中析出晶體與母液分離,其中的晶體經(jīng)重結(jié)晶獲得單晶,通過紫外、紅外光譜及X射線單晶衍射進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析;其母液則經(jīng)凝膠層析進(jìn)行分離純化;分離純化的具體方法:(1)殺線蟲活性組分單晶的分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定:發(fā)酵濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)濃縮10-20倍后,有晶體物質(zhì)析出,將析出的晶體在60-80℃下溶解后,冰箱冷藏室中或室溫下進(jìn)行重結(jié)晶,得到一個(gè)單晶;室溫下進(jìn)行重結(jié)晶得到另一個(gè)單晶;經(jīng)熔點(diǎn)、紫外、紅外光譜測定以及X射線晶體衍射進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,證明前者為含兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸,其分子式為(H2C2O4)(H2O)2,后者為8配位鉀的乙二酸配合物,其分子式為K(H2C2O4)(HC2O4)(H2O)2,其結(jié)構(gòu)見圖1;二者均有殺線蟲活性,兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸單晶最低有效劑量即MED為2mg/ml,殺蟲活性為83%,單晶8配位鉀的乙二酸配合物的最低有效劑量MED為4mg/ml,殺蟲活性為76%;(2)濾液中有機(jī)酸的分離和鑒定:離子交換柱層析:將發(fā)酵濾液用弱堿性陰離子交換樹脂進(jìn)行初步分離,上樣量10-15ml,用水或添加0.15mol/L的氯化鈉溶液平衡柱,再依次用水和稀水進(jìn)行洗脫,流速0.5ml/min-5ml/min,分部收集到不同含量的有機(jī)酸樣品,再經(jīng)高效液相分析,酸性物質(zhì)包括乙二酸,酒石酸,蘋果酸和乳酸。  
摘要 總狀共頭霉代謝物殺線蟲活性組分的分離純化方法,屬于開發(fā)新型殺線蟲生物制劑,特別涉及水溶性殺線蟲生物防菌代謝物及活性組分的分離純化方法。本發(fā)明克服了水溶性總狀共頭霉代謝物分離困難的問題;提供了其殺線蟲活性組份的分離與純化方法,其具體方法是將發(fā)酵原液,采用旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)、重結(jié)晶、弱堿性陰離子交換樹脂分離方法,經(jīng)過紫外、紅外光譜及X射線單晶衍射和高效液相色譜進(jìn)行分析鑒定。獲得了殺線蟲活性高、殺蟲譜廣、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、水溶性的新型殺線蟲生物制劑;首次證明該菌代謝物中殺線蟲活性組份含帶兩個(gè)結(jié)晶水的乙二酸和具有新型結(jié)構(gòu)的8配位鉀的乙二酸配合物,此項(xiàng)研究對線蟲的生物防治具有重要的理論意義和廣闊的應(yīng)用前景。  
國際公布  
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