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細(xì)胞角蛋白19(CK19)mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒

公開(kāi)(公告)號(hào) CN1693479A  
公開(kāi)(公告)日 2005.11.09  
申請(qǐng)(專利)號(hào) CN200510037780.8  
申請(qǐng)日期 2005.02.01  
專利名稱 細(xì)胞角蛋白19(CK19)mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒  
主分類(lèi)號(hào) C12Q1/68  
分類(lèi)號(hào) C12Q1/68;C12Q1/25  
分案原申請(qǐng)?zhí)?  
優(yōu)先權(quán)  
申請(qǐng)(專利權(quán))人 合肥中科大生物技術(shù)有限公司  
發(fā)明(設(shè)計(jì))人 田志剛;魏海明;程 民;朱聰杰  
地址 230027安徽省合肥市金寨路96號(hào)科大西區(qū)生命科學(xué)學(xué)院  
頒證日  
國(guó)際申請(qǐng)  
進(jìn)入國(guó)家日期  
專利代理機(jī)構(gòu) 合肥華信專利商標(biāo)事務(wù)所  
代理人 余成俊  
國(guó)省代碼 安徽;34  
主權(quán)項(xiàng) 細(xì)胞角蛋白19(CK19)mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒,其特征為:它包含細(xì)胞裂解液I、細(xì)胞裂解液II、RNA洗滌緩沖液I、RNA洗滌緩沖液II、無(wú)RNA酶的水、RNA分離柱、反轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTP混合物、逆轉(zhuǎn)錄酶儲(chǔ)存液、PCR反應(yīng)液、探針、標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品;以上各種溶液所用溶劑均為水;(1)、細(xì)胞裂解液I包含0.1mol/LTris-HCl(三羥甲基基甲烷-鹽酸,pH7.6,25℃)、0.1mol/L氯化鈉、0.05mol/L氯化鎂、水;(2)、細(xì)胞裂解液II包含3mol/L異硫氰酸胍、2mol/L鹽酸胍、0.3mol/L酸鈉(pH5.2)、0.2%(W/V)SDS(十二烷基硫酸鈉)、水;(3)、RNA洗滌緩沖液I包含0.2mol/L醋酸鈉(pH5.2)、0.1mol/L氯酸鈉、0.1mol/LTris-HCl(pH7.5,25℃)、水;(4)、RNA洗滌緩沖液II包含1.2mol/L檸檬酸鈉、0.5mol/LTris-HCl(pH7.5,25℃)、水;(5)、無(wú)RNA酶的水通過(guò)下列方法制得:向去離子水加入DEPC(焦碳酸二乙酯),至終濃度為0.05%(V/V),室溫(22-25℃)放置10-12小時(shí)后,121℃,20min高壓,室溫放置備用;(6)、RNA分離柱是一種硅膠柱,可以特異性結(jié)合RNA,并可用水洗脫RNA,達(dá)到分離純化RNA的目的;(7)、反轉(zhuǎn)錄緩沖液包含9.1μmol/LOligo(dT)12-18、3.6U/μlRnaseInhibitor、72.7mmol/LDTT(二硫蘇糖醇)、182mmol/LTris-HCl(pH8.3,25℃)、273mmol/LKCl、11mmol/LMgCl2、水;(8)、逆轉(zhuǎn)錄酶儲(chǔ)存液包含20mmol/LTris-HCl(pH7.5,25℃)、100mmol/LNaCl、0.1mmol/LEDTA、1.0mmol/LDTT、50%(V/V)甘油、0.01%(V/V)Nonidetp-40、200U/μl逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、水;(9)、dNTP混合物包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP,為其鈉鹽-水溶液,pH7.0-7.5,四種dNTP濃度均為10mmol/L;(10)、PCR反應(yīng)液包含18.5mmol/LTris-HCI(pH8.3,25℃)、2.78mmol/LMgCI2、92.6mmol/LKCI、上下游引物(0.37μmol/L)、0.1U/μlTaq酶、dNTP混合物(dATP,dCTP,dGTP,dTTP,其濃度均為400nmol/L)、水;上下游引物序列分別為:P1:5’-ACTACAGCCACTACTACACGAC-3’,P2:5’-CAGAGCCTGTTCCGTCTCAAAC-3’(11)、探針為熒光標(biāo)記探針,其序列為:5’-FAM-TCTGGCTGCAGATGACTTCCGAACCA-TAMRA-3’探針的濃度為:2μmol/L,TE(10mmol/LTris-HCl,1mmol/LEDTA,水)溶解;(12)、標(biāo)準(zhǔn)品的序列分別為:1CAGAGCCTGTTCCGTCTCAAACTTGGTTCGGAAGTCATCTGCAGCCAGAC51GGGCGTTGTCGATCTGCAGGACAATCCTGGAGTTCTCAATGGTGGCACCA101AGAATCTTGTCCCGCAGGTCCTGGATGGTCGTGTAGTAGTGGCTGTAGT其濃度為:106copies/μl,TE(10mmol/LTris-HCl,1mmol/LEDTA,水)溶解;(13)、對(duì)照品分為陽(yáng)性對(duì)照品與陰性對(duì)照品,陽(yáng)性對(duì)照品為有CK19cDNA的樣品(104copies/μl,TE溶解),陰性對(duì)照品為外周血總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。  
摘要 本發(fā)明涉及一種細(xì)胞角蛋白19(CK19)mRNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒,該試劑盒包含總RNA提取液(細(xì)胞裂解液I、細(xì)胞裂解液II、RNA洗滌緩沖液I、RNA洗滌緩沖液II和無(wú)RNA酶的水),反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液,dNTP混合物,逆轉(zhuǎn)錄酶,PCR反應(yīng)液,探針,陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品,對(duì)照品。本發(fā)明通過(guò)對(duì)新鮮抗凝外周血提取總RNA,并通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄mRNA樣品得到cDNA,再結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù),可準(zhǔn)確定量檢測(cè)標(biāo)本中CK19的mRNA的表達(dá)量。本發(fā)明所提供的試劑盒可用于臨床及科研中檢測(cè)腫瘤患者的外周血、骨髓、淋巴結(jié)及癌組織中CK19 mRNA的表達(dá),為各種乳腺癌、小細(xì)胞癌的早期診斷、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、治療方案的確定及預(yù)后的判斷提供重要的參考依據(jù)。  
國(guó)際公布  
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