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生產(chǎn)重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體的工藝方法

公開(公告)號 CN1221567C  
公開(公告)日 2005.10.05  
申請(專利)號 CN02134404.3  
申請日期 2002.07.19  
專利名稱 生產(chǎn)重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體的工藝方法  
主分類號 C07K14/435  
分類號 C07K14/435;C12N15/09;C12P21/02  
分案原申請?zhí)?  
優(yōu)先權  
申請(專利權)人 廣州銘康生物工程有限公司  
發(fā)明(設計)人 劉龍斌;楊琴;王敏榮;王軍志  
地址 510730 廣東省廣州市經(jīng)濟技術開發(fā)區(qū)友誼路173號  
頒證日  
國際申請  
進入國家日期  
專利代理機構 廣州知友專利代理有限公司  
代理人 邵毓琴  
國省代碼 廣東;44  
主權項 生產(chǎn)重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體的工藝方法,依次包括以下步驟:(1)定點突變天然t-PA獲得含突變位點的TNK-tPA突變體基因;(2)構建表達載體pCdhfr;(3)以XhoI/XbaI雙酶切含TNK-tPA基因的人工合成DNA序列,回收含目的基因的7Kb的DNA片段,與以XhoI/XbaI雙酶切的真核表達載體pCdhfr連接,轉化大腸桿菌E.coliJM109,以載體上的通用引物做PCR初步篩選克隆,取陽性克隆株培養(yǎng),得到重組表達質粒pCdhfr-mt-PA;(4)以TNK-tPA突變體表達質粒pCdhfr-mt-PA轉染CHO-DHFR-細胞,經(jīng)克隆和篩選獲得高水平表達TNK-tPA的工程細胞株;(5)利用細胞培養(yǎng)生物反應器持續(xù)培養(yǎng)工程細胞,收集細胞培養(yǎng)上清,經(jīng)分離純化獲得rhTNK-tPA突變體。  
摘要 本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體的工藝方法,該方法采用全長基因合成的方法合成含上述突變位點的TNK-tPA基因,在中國倉卵巢細胞(CHO-DHFR-)中表達,經(jīng)克隆和篩選獲得高水平表達TNK-tPA的工程細胞株,利用細胞培養(yǎng)生物反應器持續(xù)培養(yǎng)工程細胞,收集細胞培養(yǎng)上清,經(jīng)一系列柱層析分離純化技術,獲得rhTNK-tPA制品。本發(fā)明的目的基因在細胞中的表達水平高達18000IU/106cell/d,由此制備的rhTNK-tPA的單鏈比例高達80%以上,純度高達95%以上;對于工業(yè)化規(guī)模而言,本發(fā)明所需的設備相對比較簡單,成本低,工藝條件簡單。  
國際公布  
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