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公開(公告)號
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CN1654647A
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公開(公告)日
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2005.08.17
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申請(專利)號
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CN200510048963.X
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申請日期
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2005.01.13
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專利名稱
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利用基因工程技術(shù)在家蠶體內(nèi)生產(chǎn)重組人乳鐵蛋白的方法
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主分類號
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C12N15/09
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分類號
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C12N15/09;C12N15/10;C12N15/12;C12N15/866;C12P21/02;C07K1/14
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分案原申請?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(專利權(quán))人
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浙江大學(xué)
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發(fā)明(設(shè)計)人
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吳小鋒;姚慧鵬;曹翠平
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地址
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310027浙江省杭州市西湖區(qū)浙大路38號
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頒證日
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國際申請
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進(jìn)入國家日期
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專利代理機(jī)構(gòu)
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杭州求是專利事務(wù)所有限公司
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代理人
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林懷禹
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國省代碼
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浙江;33
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主權(quán)項
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利用基因工程技術(shù)在家蠶體內(nèi)生產(chǎn)重組人乳鐵蛋白的方法，其特征在于：(1)LF基因的克�。阂匀巳橄俳M織cDNA為模板，PCR基因擴(kuò)增技術(shù)獲得人LF基因，引物設(shè)計如下：正向引物：5′-GGATCCATGAAACTTGTCTTCCTC-3′，含有BamHI酶切位點(diǎn)；反向引物：5′-GGATCCTTACTTCCTGAGGAATTC-3′，含有BamHI酶切位點(diǎn)；PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)、溫度和時間的設(shè)計如下：一個循環(huán)，94℃模板變性50秒；30個循環(huán)，55℃退火30秒，70℃延伸2分鐘；最后1個循環(huán)，70℃延伸10分鐘；利用1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR產(chǎn)物分析，并用PCR純化試劑盒純化，獲得全長為2136bp的LF基因，隨后將LF基因克隆入3.9kb載體pCR2.1，利用雙脫氧鏈終止法在核苷酸測序儀上測序確認(rèn)克隆LF基因順序正確性；(2)含有人LF基因的重組桿狀病毒的構(gòu)建：用限制性內(nèi)切酶BamHI消化pCR2.1-LF得到LF基因片段，然后克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pBlueBacHisa獲得重組體pBlueBacHisa-LF；通過共轉(zhuǎn)染在昆蟲細(xì)胞內(nèi)與構(gòu)建的雜交桿狀病毒HyNPVDNA發(fā)生同源重組產(chǎn)生重組病毒，共轉(zhuǎn)染的方法為：1μgpBlueBacHisa-LFDNA和15μgHyNPVDNA混合，并加入14μl脂質(zhì)體lipofectin，最后加入滅菌蒸餾水至終體積40μl；將該混合液在室溫培育15分鐘后共轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的Sf21培養(yǎng)細(xì)胞，先用無血清的TC-100培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后，換成含有10％胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)基上清作為病毒原液，用來篩選重組病毒；重組病毒通過3輪空斑篩選，最終獲得高濃度純化的病毒溶液，濃度為108pfu/ml，將此重組病毒命名為HyNPV-LF；(3)家蠶體內(nèi)表達(dá)和重組LF純化：使用家蠶幼蟲5齡起蠶，接種上述重組病毒HyNPV-LF進(jìn)行感染表達(dá)；接種前，將幼蟲浸在冰水浴中麻醉10分鐘，注射用病毒懸浮液濃度為106pfu/ml，采用皮下注射的方法，每條家蠶注射20μl，注射1小時后給桑，在23-25℃下飼養(yǎng)；感染后的三天內(nèi)，看不到明顯的癥狀，到第四天，幼蟲開始食欲減弱，漸漸地呈現(xiàn)出感染癥狀；感染后地五天或第六天，感染的幼蟲大部分死亡，在此之前收集家蠶幼蟲；將幼蟲的血淋巴作為重組人LF純化的起始材料，使用以下方法收集血淋巴：在15ml收集管的上方，將幼蟲向背面彎曲，用一只手固定幼蟲的頭部和尾部，讓腹部和腹足伸向外邊；用石蠟?zāi)っ芊獾?5號針頭刺破腹足收集血液，讓血液直接滴進(jìn)收集管中，為了防止血液氧化變黑，預(yù)先加入1/10體積的10mmol/L二硫蘇糖醇DTT，使其終濃度為1mmol/L；由于重組蛋白N-末端帶有6×His尾巴，可以用Ni-NTA親和柱在非變性條件下進(jìn)行蛋白純化；從感染的幼蟲收集的血淋巴用非變性結(jié)合緩沖液，Na3PO450mmol/L，NaCl0.5mol/L，pH8.0，進(jìn)行稀釋；樣品隨后結(jié)合于Ni-NTA柱，最后，重組蛋白用含有250mmol/L咪唑的非變性洗脫緩沖液洗脫，通過SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色后鑒定重組蛋白，結(jié)果表明獲得的重組LF非常純一，從每頭家蠶獲得的產(chǎn)量為400μg。
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摘要
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本發(fā)明公開了一種利用基因工程技術(shù)在家蠶體內(nèi)生產(chǎn)重組人乳鐵蛋白的方法。利用申請人構(gòu)建的AcNPV和BmNPV的雜交桿狀病毒HyNPV作為載體，構(gòu)建了含有人LF基因的重組病毒。利用家蠶作為重組病毒的宿主，表達(dá)、生產(chǎn)了重組人LF。解決了LF在大腸桿菌中表達(dá)需要復(fù)雜的復(fù)性操作、酵母表達(dá)中質(zhì)粒轉(zhuǎn)化體不穩(wěn)定和在哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)的成本太高的缺點(diǎn)。家蠶幼蟲體內(nèi)表達(dá)的重組人LF大部分分泌在家蠶血淋巴中，非常有利于蛋白質(zhì)的快速提取，利用親和層析法純化了重組的LF，從每頭家蠶獲得的產(chǎn)量高達(dá)400μg。利用基因工程技術(shù)用家蠶作為表達(dá)載體可以大量生產(chǎn)重組LF，為它在醫(yī)學(xué)和治療領(lǐng)域上的應(yīng)用開辟了廣闊的前景。
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國際公布
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