| 公開(kāi)(公告)號(hào) | CN1204248C |
| 公開(kāi)(公告)日 | 2005.06.01 |
| 申請(qǐng)(專(zhuān)利)號(hào) | CN02114435.4 |
| 申請(qǐng)日期 | 2002.02.05 |
| 專(zhuān)利名稱(chēng) | 治療乙肝病毒感染的靶向核糖核酸酶的制備工藝 |
| 主分類(lèi)號(hào) | C12N9/22 |
| 分類(lèi)號(hào) | C12N9/22;C12N15/11;C12N15/63;C12N15/79;C12Q1/68;A61K38/46;A61P31/14 |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人 | 中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 劉軍;薛采芳 |
| 地址 | 710032 陜西省西安市長(zhǎng)樂(lè)西路17號(hào) |
| 頒證日 | |
| 國(guó)際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | |
| 專(zhuān)利代理機(jī)構(gòu) | 西安通大專(zhuān)利代理有限責(zé)任公司 |
| 代理人 | 徐文權(quán) |
| 國(guó)省代碼 | 陜西;61 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種治療乙肝病毒感染的靶向核糖核酸酶的制備工藝，其特征在于：1)hEDN編碼基因的擴(kuò)增及測(cè)序1.1根據(jù)hEDN基因序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)正向引物：5′-GCGCGGATCCACCATGAAACCTCCACAGTTTAC-3′；反向引物：5′-GCGCGAGCTCGATGATTCTATCCAGGTG-3′；正向引物及反向引物的5′端分別帶有BamHI和SacI酶切位點(diǎn)；1.2擴(kuò)增目的基因在5×106～10×106的HL-60細(xì)胞中加入1ml的Trizol，反復(fù)吹打，在15℃～30℃下放置5分鐘，然后加入0.2ml的氯仿，劇烈震動(dòng)15秒，在15℃～30℃下放置2-3分鐘后在2℃--8℃、12000g的相對(duì)離心力下離心15分鐘，吸取上層水相；在上層水相中加入0.5ml的異丙醇，在15℃～30℃下放置10分鐘后在2℃～8℃、12000g的相對(duì)離心力下離心10分鐘，去上清，得到HL-60細(xì)胞的總RNA；應(yīng)用OneStepRNAPCRkit試劑盒，在每個(gè)PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)管中加入5μl的10×OneStepRNAPCRBuffer、10μl濃度為25mmol/L的MgCl2、5μl濃度為10mmol/L的dNTP、1μl的RNaseInhibitor、1μl的AMVReverseTranscriptaseXL、1μl的AMV-optimizedTaq、1μl正向引物、1μl的反向引物、1μl的模板RNA和24μl的無(wú)RNA酶的純水混合后，分別置于50℃下30min反應(yīng)一次、94℃下2min反應(yīng)一次，然后再置于94℃下30s、55-65℃下30s、72℃延伸1-10min分別循環(huán)25-40次；2)HBVc編碼基因的擴(kuò)增及測(cè)序2.1根據(jù)HBVc編碼基因的基因序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)正向引物：5′-GCGCGAGCTCATGGACATCGACCCTTAT-3′；反向引物：5′-GCGCAAGCTTITAACATTGAGGTTCCCGAGA-3′；正向引物及反向引物的5′端分別帶有SacI和HindIII酶切位點(diǎn)；2.2擴(kuò)增目的基因向2.2.15細(xì)胞加入1ml/10cm2的Trizol，在15℃～30℃下放置5分鐘后，加入0.2ml/1mlTrizol的氯仿，劇烈震動(dòng)15秒，再在15-30℃下放置2-3分鐘后，在2℃～8℃、12000g的相對(duì)離心力下離心15分鐘，吸取上層水相；在上層水相中加入0.5ml/1mlTrizol的異丙醇，15-30℃下放置10分鐘，2℃～8℃、12000g的相對(duì)離心力下離心10分鐘，去上清，得到2.2.15細(xì)胞的總RNA；應(yīng)用OneStepRNAPCRkit試劑盒，在每個(gè)PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)管中加入5μl的10×OneStepRNAPCRBuffer、10μl濃度為25mmol/L的MgCl2、5μl濃度為10mmol/L的dNTP、1μl的RNaseInhibitor、1μl的AMVReverseTranscriptaseXL、1μl的AMV-optimizedTaq、1μl正向引物、1μl的反向引物、1μl的模板RNA和24μl的無(wú)RNA酶的純水混合后，置于50℃下30min、94℃下2min反應(yīng)一次，然后再置于94℃下30s、55-65℃下30s、72℃延伸1-10min分別循環(huán)25-40次，得到PCR產(chǎn)物；2.3克隆與測(cè)序?qū)EDN和HBVc的產(chǎn)物PCR經(jīng)1.0-1.5％瓊脂糖凝膠電泳后用NucleoTrapNucleicAcidPurificationKit試劑盒，進(jìn)行純化回收；將回收產(chǎn)物分別用BamHI和SacI、SacI和HindIII酶切后純化回收，分別與用BamHI和SacI及SacI和HindIII酶切后純化回收的pUC18連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株，以HighPurePlasmidIsolationKit試劑盒，提取質(zhì)粒，再用BamHI和SacI及SacI和HindIII酶切鑒定；序列測(cè)定采用雙脫氧鏈末端終止法，以ABI377DNA自動(dòng)序列測(cè)定儀進(jìn)行；2.4靶向核糖核酸酶真核表達(dá)載體構(gòu)建將擴(kuò)增的hEDN及HBVc編碼基因分別用BamHI和SacI、SacI和HindIII雙酶切，將真核表達(dá)載體經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切后，以T4連接酶連接hEDN、HBVc、真核表達(dá)載體酶切片段，轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞；用含Amp的固體培養(yǎng)基(LB)篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)小量提取質(zhì)粒，并酶切鑒定后，構(gòu)建hEDN-HBVc融合基因的真核表達(dá)載體；2.5帶有柔性的(Gly4Ser)3連接區(qū)的靶向核糖核酸酶真核表達(dá)載體構(gòu)建2.5.1柔性連接區(qū)編碼基因的合成首先合成兩條互補(bǔ)的寡核苷酸鏈，序列如下：P15’gcgcggatccggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctgagctcgcgc3’P25’gcgcgagctcagatccgccgccacccgacccaccaccgcccgagccaccgccaccggatccgcgc3’將上述兩條寡核苷酸鏈以無(wú)菌雙蒸水稀釋至濃度為40μmmol/L，各取15μL混勻后，分別置于94℃下5分鐘使兩條寡核苷酸鏈變性，再分別置于80℃下5分鐘、75℃下5分鐘、70℃下5分鐘、65℃下5分鐘、60℃下5分鐘、55℃下10分鐘使兩條寡核苷酸鏈復(fù)性；將復(fù)性后的產(chǎn)物經(jīng)1.5-2％瓊脂糖凝膠電泳后純化回收，即為柔性連接區(qū)編碼基因；2.5.2帶有柔性的(Gly4Ser)3連接區(qū)的靶向核糖核酸酶真核表達(dá)載體構(gòu)建將hEDN-HBVc融合基因的真核表達(dá)載體經(jīng)BamHI和SacI雙酶切后形成的大片斷命名為p/HBV；將純化回收的p/HBV與經(jīng)BamHI和SacI雙酶切的經(jīng)變性、復(fù)性后的兩條寡核苷酸鏈柔性連接區(qū)編碼基因以T4連接酶連接，形成重組質(zhì)粒p/LHBV；將p/LHBV以BamHI酶切，Klenow補(bǔ)平，HindIII酶切后，純化回收小片斷LHBV；hEDN-HBVc融合基因的真核表達(dá)載體經(jīng)SacI酶切，T4DNA多聚酶削平，HindIII酶切后，純化回收大片斷p/hEDN；將LHBV和p/hEDN以T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞；用含Amp的固體培養(yǎng)基(LB)篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)小量提取質(zhì)粒，并酶切鑒定后，構(gòu)建帶有柔性的(Gly4Ser)3連接區(qū)的靶向核糖核酸酶真核表達(dá)載體p/LTR。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開(kāi)了一種治療乙肝病毒感染的靶向核糖核酸酶的制備工藝，它通過(guò)分子生物學(xué)的手段，構(gòu)建人嗜酸性粒細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)毒素hEDN與HBV多聚酶末端蛋白結(jié)構(gòu)域DNAPTP或核心蛋白的融合蛋白，該融合蛋白即為構(gòu)建的靶向核糖核酸酶，本融合蛋白可以采取基因治療或蛋白質(zhì)藥物的方式，治療人的乙肝病毒的感染。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明構(gòu)建的靶向核糖核酸酶在體外可使乙肝表面抗原(HBSAg)下降46％-59％，可以明顯抑制乙肝病毒的復(fù)制。具體的給藥途徑和給藥方式可參照目前已有的基因治療或蛋白質(zhì)藥物的方案。 |
| 國(guó)際公布 |
