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一種用于重組tPA衍生物的大規(guī)模包涵體復(fù)性純化技術(shù)

公開(公告)號(hào) CN1613869A  
公開(公告)日 2005.05.11  
申請(專利)號(hào) CN200310108421.8  
申請日期 2003.11.05  
專利名稱 一種用于重組tPA衍生物的大規(guī)模包涵體復(fù)性純化技術(shù)  
主分類號(hào) C07K1/113  
分類號(hào) C07K1/113;C12N9/72;C12N9/00  
分案原申請?zhí)?  
優(yōu)先權(quán)  
申請(專利權(quán))人 上海中科伍佰豪生物工程有限公司  
發(fā)明(設(shè)計(jì))人 張毅;陸堅(jiān)峰;楊勝利;褚仲梅;劉成;屈賢銘  
地址 200233上海市漕寶路500號(hào)  
頒證日  
國際申請  
進(jìn)入國家日期  
專利代理機(jī)構(gòu) 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司  
代理人 徐迅  
國省代碼 上海;31  
主權(quán)項(xiàng) 一種蛋白質(zhì)復(fù)性方法,其特征在于,包括步驟:(a)將目標(biāo)蛋白質(zhì)的包涵體溶解,離心獲得溶解有包涵體蛋白質(zhì)的上清液;(b)用第一復(fù)性液稀釋上清液,形成目標(biāo)蛋白質(zhì)的濃度為100-1000微克/毫升的第一稀釋溶液,其中,第一復(fù)性液含3-7M選自尿素或鹽酸胍的變性劑和緩沖液,pH7.5-9.0,并且第一復(fù)性液中所含的化型谷胱甘肽及還原型谷胱甘肽與目標(biāo)蛋白質(zhì)之比為4-10mmol谷胱甘肽∶0.1-1mg目標(biāo)蛋白,且還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽的摩爾比為4-6∶0.8-2;(c)在20-28℃下,放置第一稀釋溶液16-24小時(shí);(d)用第二復(fù)性液稀釋第一稀釋溶液,形成目標(biāo)蛋白質(zhì)的濃度為10-100微克/毫升的第二稀釋溶液,其中,第二復(fù)性液含0.1-2.5M尿素和緩沖液,pH7.5-9.0;(e)在20-28℃下,放置第二稀釋溶液16-24小時(shí);(f)過濾第二稀釋溶液,將濾液體積超濾濃縮為原體積的1/8-1/40,獲得第一濃縮濾液;(g)過濾第一濃縮濾液,然后將濾液稀釋于3-7倍體積的pH調(diào)節(jié)緩沖液中,所述的pH調(diào)節(jié)緩沖液含有10-100mM酸堿土金屬鹽或醋酸銨,pH4.0-5.5;(h)過濾步驟(g)的稀釋溶液,將溶液體積超濾濃縮為原體積的1/3-1/10,獲得含有復(fù)性的目標(biāo)蛋白的第二濃縮濾液。  
摘要 本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)復(fù)性方法,包括步驟:(a)將目標(biāo)蛋白質(zhì)的包涵體溶解,離心獲得溶解有包涵體蛋白質(zhì)的上清液;(b)用第一復(fù)性液稀釋,其中第一復(fù)性液含氧化還原對;(c)放置一段時(shí)間;(d)用第二復(fù)性液稀釋,第二復(fù)性液不含氧化還原對;(e)放置一段時(shí)間;(f)過濾、濃縮,獲得第一濃縮濾液;(g)過濾,然后將濾液稀釋于pH調(diào)節(jié)緩沖液中,調(diào)節(jié)pH至4.0-5.5;(h)過濾步驟(g)的稀釋溶液,濃縮獲得含有復(fù)性的目標(biāo)蛋白的第二濃縮濾液。本發(fā)明復(fù)性方法成本低,用于大腸桿菌表達(dá)的重組tPA或其衍生物的低成本的重組蛋白質(zhì)。  
國際公布  
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