| 公開(公告)號 | CN1544630A |
| 公開(公告)日 | 2004.11.10 |
| 申請(專利)號 | CN200310108658.6 |
| 申請日期 | 2003.11.12 |
| 專利名稱 | 重組鴨白介素2蛋白的制備方法及其用途 |
| 主分類號 | C12N15/26 |
| 分類號 | C12N15/26;A61K39/39;A61K39/395;A61P37/06;C07K14/55 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 浙江大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 周繼勇;王金勇;吳建祥;陳吉剛 |
| 地址 | 310027浙江省杭州市西湖區(qū)浙大路38號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構(gòu) | 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 |
| 代理人 | 張法高 |
| 國省代碼 | 浙江;33 |
| 主權(quán)項 | 一種重組鴨白介素2制備方法，其特征在于它的步驟如下：1)自中國的紹興麻鴨和外來品種美洲鴨的脾淋巴細胞中克隆出鴨白介素-2的cDNA與含有PBAD啟動子的原核表達載體pBAD/hisB組建成高效表達載體pBAD/HisB/dkIL-2；或者與含有PAUG1啟動子的真核表達載體pMETαA組建成高效表達載體pMETαA/dkIL-2；2)用RM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過發(fā)酵擴增大腸桿菌工程菌LMG194；3)用BMDY作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過發(fā)酵擴增酵母工程菌PMAD11和PMAD16，在表達不同時間加氮源、碳源營養(yǎng)素；4)大腸桿菌LMG194誘導(dǎo)后經(jīng)超聲波裂解、離心去沉淀即可得到鴨白介素2粗制品，PMAD11和PMAD16表達的鴨白介素2主要以分泌形式存在于培養(yǎng)基中，經(jīng)過離心取上清即可得到鴨白介素2粗制品；用Ni-NTAArgarose蛋白純化系統(tǒng)可得到鴨白介素2純品；5)制備的重組鴨白介素2純品或非純品加入甘氨酸等穩(wěn)定劑和助溶劑后，無菌過濾、分裝和凍干后制成的成品，保存于-20℃的冷藏環(huán)境中；6)鴨白介素2單克隆抗體的制備：用重組鴨白介素2純品抗原免疫小鼠，經(jīng)細胞融合，雜交瘤細胞及陽性孔的篩選，陽性孔的特異性檢測及特異性陽性孔的克隆，液氮保存。獲得的單克隆抗體腹水純化后，液氮保存；7)鴨白介素2多克隆抗體的制備：用鴨白介素2純品抗原0.3-0.5mg，加等體積弗氏完全佐劑初次背部皮下注射免疫健康兔子，3周后加等體積弗氏不完全佐劑以同樣抗原劑量二次免疫，3周后不加佐劑其它同與前面操作進行三次免疫；7-10天后采血清，試血測其效價再次加強免疫，7天以后采血清測效價，瓊擴效價達1∶32-64，離心取上清低溫保存。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了一種重組鴨白介素2蛋白制備方法及其用途。RT-PCR擴增的不同品種鴨的鴨白介素-2cDNA片段與原核表達載體pBAD/his B載體和真核表達載體pMETαA構(gòu)建高效表達質(zhì)粒，重組表達載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌LMG194和酵母菌株P(guān)MAD11和PMAD16后誘導(dǎo)表達。大腸桿菌誘導(dǎo)后經(jīng)超聲波裂解、離心去沉淀即可得到鴨白介素-2粗制品，用蛋白純化系統(tǒng)得到鴨白介素2純品。鴨白介素-2粗制品或純品加保護劑后可以作為免疫佐劑、抗病添加劑和疾病治療藥物。鴨白介素-2單克隆抗體和多克隆抗體的制備過程簡單經(jīng)濟，可以作為良好的免疫抑制劑。本發(fā)明應(yīng)用基因工程技術(shù)制備的重組鴨白介素-2蛋白，具有工藝流程簡單，生產(chǎn)成本低，穩(wěn)定性好，生物學(xué)活性高等特點。 |
| 國際公布 |
