| 公開(公告)號(hào) | CN1459505A |
| 公開(公告)日 | 2003.12.03 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN02117369.9 |
| 申請(qǐng)日期 | 2002.05.21 |
| 專利名稱 | 中國(guó)漢族人基質(zhì)金屬蛋白酶-9基因重構(gòu)、表達(dá)、純化及其醫(yī)學(xué)應(yīng)用 |
| 主分類號(hào) | C12N15/63 |
| 分類號(hào) | C12N15/63;C12N15/70;C12N9/50;C12N15/57;C12N1/21;C07K1/14;C12Q1/37;A61K38/48 |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 趙平;胡敬群;蔡建強(qiáng) |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 胡敬群;楊建國(guó) |
| 地址 | 100021北京市朝陽(yáng)區(qū)潘家園南里17號(hào)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院 |
| 頒證日 | |
| 國(guó)際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | |
| 代理人 | |
| 國(guó)省代碼 | 北京;11 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種表達(dá)純化中國(guó)漢族人MMP-9 cDNA基因和重組PMMP-9的方法，其特征在于：包括以下步驟：(1)、克隆中國(guó)漢族人MMP-9的基因，用反轉(zhuǎn)錄PCR法擴(kuò)增MMP-9的基因；(2)、將上述擴(kuò)增的MMP-9基因與克隆載體連接，構(gòu)建人MMP-9克隆質(zhì)粒；(3)、將上述人MMP-9克隆質(zhì)粒亞克隆進(jìn)表達(dá)載體，再將連接后的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染大腸桿菌；(4)、表達(dá)中國(guó)漢族人MMP-9a、將上述帶有中國(guó)漢族人MMP-9基因的表達(dá)載體的大腸桿菌鋪含有抗生素的LB培養(yǎng)基板，將板放置37℃溫箱過(guò)夜培養(yǎng)；b、從板上選一個(gè)菌落，放入裝LB培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，在30℃搖箱內(nèi)培養(yǎng)，測(cè)菌液A650 OD值為1.0時(shí)停止培養(yǎng)；c、向菌液內(nèi)加IPTG，使其終濃度為0.5mM，繼續(xù)培養(yǎng)6-8小時(shí)；d、收獲細(xì)菌；(5)、純化人MMP-9a、將上述細(xì)菌沉淀用pH8.0的磷酸鹽緩沖液洗一次，離心后，再用pH8.0的磷酸鹽緩沖液懸浮沉淀；b、裂解細(xì)菌，離心取上清液；c、初步純化人MMP-9；d、用離子交換和凝膠過(guò)濾層析進(jìn)行純化。(6)、重組中國(guó)漢族人PMMP-9基因的構(gòu)建a、以MMP-9質(zhì)粒DNA為模板以新引物作PCR擴(kuò)增得到MMP-9的衍生物PMMP-9；b、將PCR產(chǎn)物PMMP-9克隆到克隆載體質(zhì)粒上；c、經(jīng)酶切將PMMP-9基因亞克隆到表達(dá)載體；(7)、重組中國(guó)漢族人PMMP-9蛋白的表達(dá)和純化a、將上述帶有重組中國(guó)漢族人PMMP-9基因的表達(dá)載體的大腸桿菌鋪含有抗生素的LB培養(yǎng)基板，將板放置37℃溫箱過(guò)夜培養(yǎng)；b、從板上選一個(gè)菌落，放入裝LB培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，在30℃搖箱內(nèi)培養(yǎng)，測(cè)菌液A650 OD值為1.0時(shí)停止培養(yǎng)；c、向菌液內(nèi)加IPTG，使其終濃度為0.5mM，繼續(xù)培養(yǎng)6-8小時(shí)；d、收獲細(xì)菌；e、將上述細(xì)菌沉淀用pH8.0的磷酸鹽緩沖液洗一次，離心后，再用pH8.0的磷酸鹽緩沖液懸浮沉淀；f、裂解細(xì)菌，離心取上清液；g、初步純化重組人PMMP-9；h、用離子交換和Ni-NTG-His柱親和層析進(jìn)行純化。 |
| 摘要 | 本發(fā)明涉及一種中國(guó)漢族人MMP-9基因的克隆、重組、表達(dá)、純化方法與專用引物，以及MMP-9蛋白及其類似物、衍生物在肝癌臨床診斷和治療方面的應(yīng)用。本方法將獲得的中國(guó)漢族人肝細(xì)胞cDNA，用PCR方法(引物1為5′CATGAGCCTCTGGCAGCCCCT引物2為5′GACGGGAGCCCTAGTCCTCAG)獲得人MMP-9基因，并將該基因重組后克隆到大腸桿菌表達(dá)載體中，誘導(dǎo)表達(dá)后提取MMP-9及其衍生物PMMP-9，進(jìn)而應(yīng)用離子交換柱層析和凝膠過(guò)濾純化出MMP-9及其衍生物PMMP-9，為臨床進(jìn)一步觀察腫瘤病人體內(nèi)MMP-9水平的變化，奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。 |
| 國(guó)際公布 |
