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三 提取和純化
提取是將經(jīng)過處理或破碎的細胞，置于一定的條件和溶液中，讓被提取的生物大分子充分釋放出來的過程。影響提取的因素主要是被提取物質(zhì)在提取的溶液中溶解度的大小及由固相擴散到液相的難易程度。某一物質(zhì)在溶劑中溶解度大小與該物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及溶劑理化性質(zhì)有關，一般遵守“相似相溶”的原則。擴散作用對生物大分子的提取有一定的影響。減小溶劑的粘度、攪拌和延長提取時間可提高其擴散速度，增加提取效果，提取的原則是“少量多次”，即對于等量的提取溶液，分多次提取比一次提取效果好得多。
（一)蛋白質(zhì)（包括酶)的提取
大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機溶劑中，因此，可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)及酶。
1、水溶液提取法
稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好，溶解度大，是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1～5倍，提取時需要均勻地攪拌，以利于蛋白質(zhì)的溶解。提取的溫度一般采用低溫（５℃以下)操作。為了避免蛋白質(zhì)提取過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸、碘乙酸等)。
下面著重討論提取液的pH和鹽濃度的選擇：
（１)pH 蛋白質(zhì)和酶是具有等電點的兩性電解質(zhì)，提取液的pH應選擇在偏離等電點兩側(cè)的pH范圍內(nèi)。用稀酸或稀堿提取時，應防止過酸或過堿而引起蛋白質(zhì)可解離基團發(fā)生變化，從而導致蛋白質(zhì)構(gòu)象的不可逆變化，一般來說，堿性蛋白質(zhì)用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質(zhì)用偏堿性的提取液提取。
（２)鹽濃度 稀鹽溶液可促進蛋白質(zhì)的溶解，稱為鹽溶作用醫(yī)學.全在.,線提,供payment-defi.com。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質(zhì)部分結(jié)合，具有保護蛋白質(zhì)不易變性的優(yōu)點，因此在提取液中加入少量NaCL等中性鹽，一般以0.15mol/L濃度為宜。緩沖液常采用0.02～0.05mol/L磷酸鹽或碳酸鹽的等滲鹽溶液。
2、有機溶劑提取法
一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶，可用乙醇、丙酮或丁醇等有機溶劑提取。它們具有一定的親水性，還有較強的親脂性，是理想的提取脂蛋白的提取液，但必須在低溫下操作。
丁醇提取法對提取一些與脂質(zhì)結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)和酶特別優(yōu)越，一是因為丁醇親脂性強，特別是溶解磷脂的能力強；二是丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內(nèi)不會引起酶的變性失活。另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用于動植物及微生物材料。
（二)蛋白質(zhì)的分離純化
蛋白質(zhì)的分離純化方法很多，主要有以下幾類。
1、根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法
(１)蛋白質(zhì)的鹽析 中性鹽對蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質(zhì)的溶解度增加，稱為鹽溶；當鹽濃度繼續(xù)升高時，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現(xiàn)象叫鹽析。將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子如硫酸銨有很強的水化作用，可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層，使之“失水”，于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出。鹽析時若溶液ｐＨ在蛋白質(zhì)等電點則效果更好。由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。
蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。其中應用最多的是硫酸銨，它的優(yōu)點是溶解度的溫度系數(shù)小而溶解度大（25℃時飽和溶液為4.1mol/L，即541.2ｇ/Ｌ；０℃時溶解度為3.9mol/L(514.8ｇ/Ｌ)，在這一溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質(zhì)變性。硫酸銨溶液的ｐＨ常在4.5～5.5之間，當用其他ｐＨ進行鹽析時，需要硫酸或氨水調(diào)節(jié)。
蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋內(nèi)（常用的是玻璃紙)，用緩沖液進行透析，并不斷地更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。此外也可用葡聚糖凝膠Ｇ—２５或Ｇ－５０過柱的辦法除鹽，所用的時間比較短。
(２)等電點沉淀法 蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質(zhì)的等電點有差別，可利用調(diào)節(jié)溶液的ｐＨ達到某一蛋白質(zhì)的等電點使之沉淀，但此法很少單獨使用，可與鹽析法結(jié)合使用。
(３)低溫有機溶劑沉淀法 用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出。此法分離效率比鹽析高，但蛋白質(zhì)較易變性，應在低溫下進行。
2、根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法
（１)透析與超濾 透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分子分開。超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質(zhì)分子通過半透膜，而蛋白質(zhì)留在膜上，可選擇不同孔徑的濾膜截留不同相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)。
（２)凝膠過濾法 也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠（詳見層析技術)。
3、根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進行分離
蛋白質(zhì)在不同ｐＨ環(huán)境中帶電性質(zhì)和電荷數(shù)量不同，可將其分開。
（１)電泳法 各種蛋白質(zhì)在同一ｐＨ條件下，因相對分子質(zhì)量和電荷數(shù)量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開（詳見電泳技術)。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體，電泳時兩性電解質(zhì)形成一個由正極到負極逐漸增加的ｐＨ梯度，當帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動時，到達各自等電點的ｐＨ位置就停止，此法可用于分析和制備各種蛋白質(zhì)。
（２)離子交換層析法 離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素)和陰離子交換劑（二乙基氨基乙基纖維素)，當被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上，隨后用改變ｐＨ或離子強度的辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來（詳見層析技術)。
4、根據(jù)配體特異性的分離方法———親和層析法
親和層析法是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法，它通常只需經(jīng)過一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法是根據(jù)某些蛋白質(zhì)與另一種稱為配體的分子能特異而非共價地結(jié)合。例如，酶－輔酶，抗原－抗體，激素－受體等。（親和層析的基本原理詳見層析技術)
蛋白質(zhì)在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)的分離、提純和鑒定是生物化學中的重要部分，至今還沒有一個單獨或一套現(xiàn)成的方法能把任何一種蛋白質(zhì)從復雜的混合蛋白質(zhì)中提取出來，因此往往采取幾種方法聯(lián)合使用。
（三)核酸的提取
核酸都溶于水，而不溶于有機溶劑，利用此性質(zhì)進行提取。在細胞內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成脫氧核糖核蛋白（DNP)，RNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成核糖核蛋白（RNP)，在不同濃度的鹽溶液中它們的溶解度差別很大，DNP在純水或1 mol/LNaCl溶液中溶解度較大，但在0.14mol/LNaCl溶液中溶解度很低，相反，RNP易溶解。因此，用0.14mol/LNaCl溶液可簡單地初步分開DNP和RNP。
在分離核酸中最困難的是將核酸與緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開，而且還要避免核酸的降解。常用的解離劑是陰離子去垢劑，如脫氧膽酸鈉，十二烷基硫酸鈉（SDS)，４－氨基水楊酸鈉和萘－1，5－二磺酸鈉等，它們具有溶解病毒、細菌的作用，可使核酸從蛋白質(zhì)上游離出來，還具有抑制核糖核酸酶的作用。另外除去核酸中的蛋白質(zhì)的一個有效辦法是用酚－氯仿混合液，它們可使蛋白質(zhì)變性，并對核糖核酸酶有抑制作用，另外氯仿比重大可使有機相和水相完全分開，減少殘留在水相中的酚。在用酚－氯仿抽提核酸提取液時，還須要劇烈振搖，為防止起泡和促使水相與有機相的分離，在酚－氯仿抽提液中再加上一定量的異戊醇。
（四)核酸的純化
核酸的純化最關鍵步驟是去除蛋白質(zhì)，通常只要用酚／氯仿、氯仿抽提核酸的水溶液即可。每當需要把DNA克隆操作的某一步所用的酶滅活或去除以便進行下一步時，可進行這種抽提。然而，如果從細胞裂解液等復雜的分子混合物中純化核酸，則要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白質(zhì)后，再用有機溶劑抽提。這些廣譜的蛋白酶包括鏈霉蛋白酶及蛋白酶Ｋ等，它們對多數(shù)天然蛋白質(zhì)均有活性。
用酚／氯仿抽提：這兩種有機溶劑合用，比單獨用酚抽提除蛋白效果更佳。繼而用氯仿抽提則可除去核酸制品中的痕量酚。具體步驟如下：
①核酸樣品置有蓋小離心管中，加入等體積的酚／氯仿；②旋渦混勻管內(nèi)容物，使呈乳狀；③12000ｇ室溫離心15ｓ；④水相移入另一離心管，棄去兩相界面和有機相；⑤重復步驟①～④，直至兩相界面上無蛋白質(zhì)為止；⑥加入等體積的氯仿并重復②～④步操作；⑦按下述核酸濃縮法沉淀回收核酸。
(五)核酸的濃縮
應用最廣的核酸濃縮法是乙醇沉淀法。在中等濃度單價陽離子存在下，加入一定量的乙醇后，所形成的核酸沉淀可經(jīng)離心而回收。甚至對低至ｐｇ（皮克)量的DNA或RNA，也可定量回收。回收的核酸可按所需濃度，再溶于適當?shù)木彌_液中。具體操作時，可向含樣品的小離心管中加入單價陽離子鹽貯存液。單價陽離子鹽的選擇，主要基于下述考慮：用醋酸銨可減少dNTP的共沉淀，但在以后要作核酸的磷酸化時應避免用醋酸銨，因銨離子是多核苷酸激酶的強烈抑制劑。當用較高濃度的乙醇沉淀RNA時，常用LiCl，因LiCl在乙醇中溶解度很高，不隨核酸共沉淀。含有SDS的核酸樣品，應使用NaCl，這時該去垢劑在70％乙醇中仍保持可溶。
DNA和RNA的沉淀，大多使用醋酸鈉（pＨ5.2)。
