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2 器材
2.1 儀器
分析天平、高速離心機、真空干燥器、PCR擴增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀（或紫外分析儀)、液氮或-70℃冰箱、微波爐、組織研磨器、-20℃冰箱、可調移液器（2µL 、20µL、200µL、1000µL)。
2.2 耗材
眼科剪、眼科鑷、稱量紙、20 mL一次性注射器、1.5 mL滅菌離心管、0.2 mL薄壁PCR管、瓊脂糖、500 mL量筒、500 mL錐形瓶、吸頭(10µL、200µL、1000µL)、滅菌雙蒸水。
2.3 引物設計
根據GenBank上已發(fā)表的炭疽桿菌POX1質粒序列，設計并合成了以下兩條引物：
ATXU：5’-AGAATGTATCACCAGAGGC-3’ ATXD：5’-GTTGTAGATTGGAGC
CGTC-3’，此對引物擴增片段為394bp。
2.4 樣品的采集與處理
2.4.1 樣品的采集
病死或撲殺的動物取肝臟或脾；待檢的活動物，用注射器取血5～10mL，2～8℃保存，送實驗室檢測。
2.4.2 樣品的處理
每份樣品分別處理。
2.4.2.1 組織樣品處理
稱取待檢病料0.2g，置研磨器中剪碎并研磨，加入2mL消化液繼續(xù)研磨。取已研磨好的待檢病料上清100µL加入1.5 mL滅菌離心管中，再加入500µL消化液和10µL蛋白酶K溶液，混勻后，置55℃水浴中4～16h。
2.4.2.2 待檢菌的處理
取培養(yǎng)獲得的菌落，重懸于生理鹽水中。取其懸液100µL加入1.5mL滅菌離心管中，再加入500µL 消化液和10µL 蛋白酶K溶液，混勻后，置55℃水浴中過夜。
2.4.2.3 全血樣品處理
待血凝后取上清放于離心管中，4℃ 8000 g離心5 分鐘，取上清100µL，加入500µL消化液和10µL蛋白酶K溶液，混勻后，置55℃水浴中過夜。
2.4.2.4 陽性對照處理
取培養(yǎng)的炭疽桿菌，重懸于生理鹽水中。取其懸液100µL，置1.5 mL滅菌離心管中，加入500µL消化液和10µL蛋白酶K溶液，混勻后，置55℃水浴中過夜。
2.4.2.5 陰性對照處理
取滅菌雙蒸水100µL，置1.5 mL滅菌離心管中payment-defi.com，加入500µL 消化液10µl蛋白酶K溶液，混勻后，置55℃水浴中過夜。
2.5 DNA模板的提取
2.5.1 取出已處理的樣品及陰、陽對照，加入600µL酚/氯仿/異戊醇混合液，用力顛倒10次混勻，12000g離心10分鐘。
2.5.2 取上清置1.5mL滅菌離心管中，加入等體積異丙醇，混勻，置液氮中3分鐘。取出樣品管，室溫融化，15000rpm離心15分鐘。
2.5.3 棄上清，沿管壁緩緩滴入1ml 70%乙醇，輕輕旋轉洗一次后倒掉，將離心管倒扣于吸水紙上1分鐘，真空抽干15分鐘(以無乙醇味為準)。
2.5.4 取出樣品管，用50µL滅菌雙蒸水溶解沉淀，作為模板備用。
2.6 PCR擴增
總體積20µl，取滅菌雙蒸水8µl,2.5mmol/L dNTP、8pmol/µL擴增引物、15mmol/L氯化鎂、10×PCR緩沖液、0.5單位TaqDNA聚合酶各2µL，2µL模板DNA�；靹颍骱脴擞�，加入礦物油20µL覆蓋(有熱蓋的自動DNA熱循環(huán)儀不用加礦物油)。擴增條件為94℃ 3分鐘后，94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s循環(huán)35次，72℃延伸 5分鐘。
2.7 電泳
將PCR擴增產物15µL混合3µL上樣緩沖液，點樣于1.5%瓊脂糖凝膠孔中，以5V/cm電壓于1×TAE緩沖液中電泳，紫外凝膠成像儀下觀察結果。
2.8 結果判定
在陽性對照出現394bp擴增帶、陰性對照無帶出現(引物帶除外)時，試驗結果成立。被檢樣品出現394bp擴增帶為炭疽桿菌陽性，否則為陰性。
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