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2．1．2 Bb的染色及鏡檢
挑取直徑l mm左右、半透明、光滑、濕潤(rùn)的典型菌落進(jìn)行革蘭氏染色，將革蘭氏陰性、兩極著色、散在或成對(duì)排列、呈細(xì)小球桿狀菌的菌落定為可疑菌落。對(duì)可疑菌落進(jìn)行傳代純化，用于繼續(xù)鑒定。也可以將病料或初代分離的細(xì)菌接種小鼠，對(duì)死亡小鼠剖檢，取心血分離鑒定細(xì)菌，以提高菌株的分離率和毒力。
2．1．3 Bb的生化鑒定
Bb的特征性生化反應(yīng)包括氧化／發(fā)酵(O／F)、葡萄糖磷酸鹽胨水(MR、VP肉湯)、西蒙氏枸櫞酸鈉、葡萄糖、乳糖、吲哚、硫化氫、硝酸鹽還原、尿素、觸酶和氧化酶、液化明膠等。將Bb接種于上述生化反應(yīng)管中，Bb尿素酶試驗(yàn)陽(yáng)性、,能利用檸檬酸鹽、還原硝酸鹽、不產(chǎn)生靛基質(zhì)、不產(chǎn)生硫化氫、MR和VP試驗(yàn)均為陰性、不液化明膠，不氧化也不發(fā)酵包括葡萄糖在內(nèi)的所有糖。
2．1．4 Bb的致病性實(shí)驗(yàn)
對(duì)分離的Bb需進(jìn)行動(dòng)物致病性實(shí)驗(yàn)以確定其毒力和致病性。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可以為小鼠、豚鼠或豬。將Bb分離株通過(guò)氣管注射和滴鼻途徑接種30日齡仔豬進(jìn)行感染試驗(yàn)，接種豬出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)癥狀，采集感染豬鼻拭子，進(jìn)一步分離鑒定Bb。陳武森等選用豚鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站payment-defi.com，將臨床分離的致病波氏桿菌I相菌的肉湯培養(yǎng)物通過(guò)腹腔注射，解剖觀察有皮下、腸、肝、心出血，伴有腹水、膽囊腫大等病變，隨后從死亡豚鼠組織中分離鑒定細(xì)菌。
2．2 Bb的血清學(xué)鑒定
Bb的血清學(xué)鑒定方法包括使用Bb標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和Bb的O(菌體抗原)、K(莢膜抗原)因子抗血清作平板凝集實(shí)驗(yàn)。將Bb分離菌株的24 h培養(yǎng)物分別與Bb標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清混合，如產(chǎn)生凝集反應(yīng)而與陰性對(duì)照血清無(wú)反應(yīng)者為Bb。
Bb具有由莢膜抗原和菌毛抗原組成的K抗原和菌體O抗原，故可以使用Bb O、K因子抗血清作平板凝集實(shí)驗(yàn)。Bb I相菌表面K抗原將菌體O抗原完全遮閉，因此它只能與抗K因子血清發(fā)生凝集反應(yīng)。III相菌不具有表面K抗原，只有菌體O抗原，因此它只能與抗O因子血清發(fā)生凝集反應(yīng)。II相菌介于I相菌和III相菌之間，具有表面K抗原，但不能將菌體O抗原全部遮閉，因此它與K因子血清和O因子血清均能發(fā)生凝集反應(yīng)。
2．3 Bb的分子生物學(xué)鑒定方法
關(guān)于Bb分子機(jī)制等方面的研究已經(jīng)較為深入，然而關(guān)于Bb檢測(cè)方法的報(bào)道卻很少。僅有利用核糖分型法、脈沖凝膠電泳法和限制性酶切分析法來(lái)檢測(cè)Bb的報(bào)道，然而這些方法都是用于區(qū)分不同宿主間Bb的同源性，并不適合于臨床診斷。現(xiàn)今用于支氣管敗血波氏桿菌的分子生物學(xué)鑒定方法包括菌落雜交分析法和PCR法。
2．3．1菌落雜交分析法鑒定Bb
美國(guó)Register等應(yīng)用雙色雜交法同時(shí)檢測(cè)Bb和TPm。通過(guò)雙熒光標(biāo)記的抗體可以同時(shí)雜交4700 bp的BbalcA基因和大小l 200 bp的T+Pm toxA基因探針，alcA為地高辛標(biāo)記，雜交后有Bb存在處顯粉紅色，取樣3 d后即可獲得結(jié)果。檢測(cè)表現(xiàn)AR臨床癥狀的84份鼻拭子樣品，檢測(cè)結(jié)果與其他常規(guī)鑒定方法對(duì)比有極高的敏感性和特異性，而且該法是一種菌落雜交分析法，鑒定細(xì)菌從初級(jí)培養(yǎng)物中的單一菌落挑選，不需要對(duì)受檢細(xì)菌進(jìn)行純代培養(yǎng)，但是操作過(guò)程復(fù)雜，需要專(zhuān)門(mén)的研究技術(shù)人員才能完成。因此，該方法的普遍利用還有一定的局限性。www.powerpigs.net
2．3．2 PCR方法檢測(cè)Bb
Hozbor等針對(duì)Bb鞭毛基因的上游序列設(shè)計(jì)的引物建立了PCR的檢測(cè)方法，該方法可以擴(kuò)增出Bb特異性的大小為237 bp的片段，并能夠和百日咳波氏桿菌(B．pertussis)及副百日咳波氏桿菌(B．psrapertussis)區(qū)別開(kāi)。且細(xì)菌只需要經(jīng)過(guò)初代培養(yǎng)即可作為PCR的模板使用醫(yī)學(xué).全在.線payment-defi.com，該法具有很好的特異性和敏感性，細(xì)菌量少于l0個(gè)的樣本也可以直接檢出。國(guó)內(nèi)魯承等利用多重PCR方法可以同時(shí)鑒定Bb和T+Pm感染。使用PCR方法不需做目的菌的分離培養(yǎng)，在高濃度的目的菌存在時(shí)，不必做增菌培養(yǎng)，可直接從所采取的鼻腔分泌物中分離DNA應(yīng)用于檢測(cè)，并且不必考慮雜菌的過(guò)度增殖，為臨床上確定豬傳染性萎縮性鼻炎病原菌感染建立了新途徑。楊詠潔等證實(shí)PCR檢測(cè)的檢出率是細(xì)菌檢查法的5．25倍，是微量凝集法的1．75倍，具有較好的特異性和敏感性。
綜上所述，豬源支氣管敗血波氏桿菌是豬的重要病原菌，現(xiàn)有的分離鑒定方法均存在實(shí)驗(yàn)條件要求高、操作繁瑣等缺點(diǎn)，亟需開(kāi)發(fā)更多靈敏性高、特異性好、可在現(xiàn)場(chǎng)使用的快速診斷方法。
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