核酸的序列分析，即核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，是現(xiàn)代分子生物學(xué)中一項(xiàng)重要技術(shù)。目前應(yīng)用的兩種快速序列測(cè)定技術(shù)是Sanger等（1977年)提出的雙脫氧鏈終止法及Maxam和Gilbert（1977年)提出的化學(xué)降解法，其中雙脫氧鏈終止法是目前應(yīng)用最多，最好的技術(shù)。
一、Sanger雙脫氧鏈終止法原理
通常DNA的復(fù)制需要：DNA聚合酶，單鏈DNA模板，帶有3"-OH末端的單鏈寡核苷酸引物，4種dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP)。聚合酶用模板作指導(dǎo)，不斷地將dNTP加到引物的3"-OH末端，使引物延伸，合成出新的互補(bǔ)DNA鏈。如果加入一種特殊核苷酸，雙 脫氧核苷三磷酸（ddNTP)，因?yàn)樗c普通dNTP不同，在脫氧核糖的3’位置缺少一個(gè)羥基，故不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵。例如，存在ddCTP、dCTP和三種其他的dNTpayment-defi.com/shiti/P（其中一種為α-32P標(biāo)記)的情況下，將引物、模板和DNA聚合酶一起保溫，即可形成一種全部具有相同的5"-引物端和以ddC殘基為3’端結(jié)尾的一系列長(zhǎng)短不一片段的混合物。經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離制得的放射性自顯影區(qū)帶圖譜將為新合成的不同長(zhǎng)度的DNA鏈中C的分布提供準(zhǔn)確信息，從而將全部C的位置確定下來(lái)。采用類似的方法，在ddATP、ddGTP和ddTTP存在的條件下，可同時(shí)制得分別以ddA、ddG和ddT殘基為3"端結(jié)尾的三組長(zhǎng)短不一的片段。將制得的四組混合物全部平行地點(diǎn)加在變性聚丙烯酸受凝膠電泳板上進(jìn)行電泳，每組制品中的各個(gè)組分將按其鏈長(zhǎng)的不同得到分離，從而制得相應(yīng)的放射性自顯影圖譜。從所得圖譜即可直接讀得DNA的堿基序列，見(jiàn)圖24-3所示。
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圖24－3 雙脫氧鏈末端終止法測(cè)序基本原理示意圖
二、雙脫氧鏈止終法測(cè)定戰(zhàn)略
由于DNA一般都由幾千個(gè)單核苷組成。而目前測(cè)定DNA序列的最好方法，一次也只能測(cè)約600個(gè)核苷酸，因此進(jìn)行DNA順序測(cè)定前，需要用不同限制酶消化等測(cè)DNA，使其降成小片段，分別克隆到pUC1,18pUCl18,pUC19,M13mp18,M13mp19等載體中，分別測(cè)定各小片段的順序，由于不同限制酶產(chǎn)生的片段之間有交錯(cuò)重疊順序，根據(jù)片段間和末payment-defi.com/wsj/端重疊序列，用計(jì)算機(jī)軟件如Mac Vector TM5.0分析DNA，Assemblylign TM排列出各片段的位置，進(jìn)而排出DNA的全序列。
三、雙脫氧鏈終止法測(cè)定方法
以M13噬菌體為載體的雙氧鏈終止法的實(shí)施步驟為例：
1．M13噬菌體復(fù)制型雙鏈DNA（RFDNA)的制備。
為了將待測(cè)雙鏈DNA進(jìn)行克隆，必須制備M13mp18或M13 mp19復(fù)制型（閉環(huán)雙鏈)DNA，從M9培養(yǎng)基中，挑起單個(gè)克隆大腸桿菌，JM101到50ml2×YT培養(yǎng)基中，37℃振蕩過(guò)夜。稀釋1ml培養(yǎng)物到50ml2×YT培養(yǎng)中，于37℃振搖6h，轉(zhuǎn)移2ml培養(yǎng)物于微量離心管中，12000g，離心5min細(xì)菌沉淀保留用于分離復(fù)制型RFDNA，上清用于分離噬菌體單鏈DNA。
細(xì)菌沉淀用于分離復(fù)制型DNA，可以采用標(biāo)準(zhǔn)的堿解方法或采用天美公司的Wizard Miniperps DNA試劑盒制備。（方法同分離質(zhì)粒DNA方法)。
2．重組噬菌體制備
采用多克隆位點(diǎn)上的限制性內(nèi)加酶切割待測(cè)DNA，并采用相同內(nèi)切酶切割M13噬菌體RFDNA（采用Biol 101gene clean Ⅱ試劑盒分別純化內(nèi)切酶切割后的DNA片段)，然后將待測(cè)外源DNA片段與M13復(fù)制型載體DNA連接過(guò)夜，連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)染JM101感受態(tài)細(xì)菌，將連接物10μl與200μl感受態(tài)細(xì)菌混勻，放置冰上40～50min，再放在42℃水浴2min，然后加入1ml新鮮的靜止相JM101培養(yǎng)物混勻，然后分別以300μl于含有IPIG（200mg/ml)和X-gal200mg/ml的2×YT培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)8h即可出現(xiàn)藍(lán)色和白色噬斑，白色或稱無(wú)菌噬斑，即為陽(yáng)性重組噬菌體。
3．單鏈?zhǔn)删wDNA（模板DNA)的制備
上述平板的每個(gè)白色噬菌斑是由一種重組M13DNA分子轉(zhuǎn)染細(xì)菌后產(chǎn)生的，如果取一個(gè)白色噬菌斑進(jìn)行培養(yǎng)便可得到一種單鏈形式的DNA。為此，挑取一個(gè)白色噬菌斑轉(zhuǎn)接到一個(gè)新鮮制備的OD600=0.1的大腸桿菌JM101培養(yǎng)物中，于37℃振搖5h左右，12000g離心10min，上清轉(zhuǎn)移到另一新微量離心管中用于分離單鏈DNA，按1ml上清液中加入含20%聚乙二醇PEG-6000的2.5m NaCl 200μl沉淀噬菌體，再用飽和酚抽提除去噬菌體蛋白，最后用1/10體積的3m NaAc和乙醇沉淀單鏈DNA，濃度調(diào)至0.1～0.5μg/μl，也可采用天美公司的Wizard TM M13DNA純化試劑盒分離純化M13單鏈DNA。
4．引物制備
可以購(gòu)買(mǎi)通用引物或?qū)嶒?yàn)室合成15bp～26bp長(zhǎng)度的引物，通常以2μg/ml的濃度貯存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>
5．微量滴板
進(jìn)行大批量的模板測(cè)序時(shí)，常在密閉的微量離心管中進(jìn)行與引物的退火反應(yīng)，然后在微量滴板中進(jìn)行鏈延伸-鏈終止反應(yīng)。
6．變性聚丙烯酰胺凝膠
測(cè)序凝膠裝置的大小形狀均不相同，其主要參數(shù)有：①長(zhǎng)度通常為40～50cm；②寬度通常為20cm；③厚度通常為0.3～0.4mm；④橫截面形狀為楔形或錐形，即頂部薄，底部厚，或者是將底部凝膠緩沖液的濃度提高；⑤加樣槽；⑥整塊凝膠上的溫度應(yīng)均一。
7．電泳后將凝膠干燥，放射自顯影。
8．凝膠上讀取DNA序列。
此時(shí)讀取的是目的DNA的互補(bǔ)鏈3"～5"的序列。
