Cutbert等發(fā)現(xiàn)缺乏內(nèi)源性和外源性膽固醇時(shí),培養(yǎng)于僅含微量LDL營(yíng)養(yǎng)液中的人外圍血淋巴細(xì)胞,其生長(zhǎng)和增生均依賴與細(xì)胞膜表面LDL-R的存在,根據(jù)這一原理建立了3H-TdR(3H-thymidine,3H-胸腺嘧啶)摻入法檢測(cè)人淋巴細(xì)胞LDL-R的活性。楊建新等改進(jìn)了本法,減少用血量,但是未能避免使用同位素,簡(jiǎn)述止法。
檢測(cè)原理:細(xì)胞分裂增殖所需的大量膽固醇主要通過內(nèi)源性膽固醇合成,以及加速細(xì)胞膜LDL-R介導(dǎo)的特異性結(jié)合,攝取血LDL中的外源性膽固醇而獲得,當(dāng)用mevinolin(膽固醇合成的限速酶HMG-CoA還原酶的抑制劑)阻斷細(xì)胞內(nèi)源性膽固醇的合成,并使細(xì)胞外環(huán)境中LDL濃度降低至無非特異性外源膽固醇攝取時(shí),細(xì)胞分裂生長(zhǎng)完全取決與細(xì)胞膜表面LDL-R活性,摻入3payment-defi.com/jianyan/H-TdR量與細(xì)胞生長(zhǎng)成正比例關(guān)系。
實(shí)驗(yàn)方法:采空腹靜脈血5~6ml,肝素抗凝,測(cè)血漿血脂,并分離出淋巴細(xì)胞;將細(xì)胞分成實(shí)驗(yàn)組(加含mevinolin的二甲亞礬)和對(duì)照組(加不含mevinolin的二甲亞礬),在同樣條件下(50μg/mlPHA,5μg/mlLDL-C,37℃,5%CO2,飽和濕度)培養(yǎng)96h,分別加入0.5μCi3H-TdR,混勻后繼續(xù)培養(yǎng)6h,收集細(xì)胞至玻璃纖維紙上測(cè)cpm值。
其計(jì)算公式為:
淋巴細(xì)胞分裂抑制率(%)=(1-Δcpm實(shí)驗(yàn)組/Δcpm對(duì)照組)×100%
采用本法正常淋巴細(xì)胞分裂抑制率<20%;FH雜合子淋巴細(xì)胞分裂抑制率>60%,故可將FH患者與正常人以及普通的高脂血癥區(qū)別開來。
MTT比色法是孟凡青等根據(jù)3H-TdR摻入法為避免使用同位素而改用四甲基偶氮唑鹽(MTT)建立的一種快速、方便的方法。MTT比色法僅需采空腹靜脈血1~2ml,培養(yǎng)90h后,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別加入MTT溶液(3mg/ml),再培養(yǎng)2h,抽吸上清,加0.04mol/HCL-異內(nèi)醇,充分溶解,在酶標(biāo)儀上測(cè)吸光度(A)值。詳細(xì)操作流程見圖20-2。
圖20-2 MTT比色法檢測(cè)LDL-R操作流程
細(xì)胞分裂抑制率計(jì)算公式為:
淋巴細(xì)胞分裂抑制率(%)=(1-ΔA實(shí)驗(yàn)組/ΔA對(duì)照組)×100%
正常人淋巴細(xì)胞分裂抑制率為0~18%;FH雜合子淋巴細(xì)胞分裂抑制率為21%~58%;FH純合子淋巴細(xì)胞分裂抑制率為36%~60%。
經(jīng)實(shí)驗(yàn)比較MTT比色法與經(jīng)典的3payment-defi.com/pharm/H-TdR摻入法測(cè)定的結(jié)果基本相符,但是后者敏感性更強(qiáng),可以一步將FH雜合子和FH純合子區(qū)分開來。由于MTT比色法不需使用昂貴的儀器和同位素,用血量少,適合一般實(shí)驗(yàn)室及臨床檢驗(yàn)科室的臨床診斷,可用于人群FH篩查,這對(duì)于減少雜合子之間的婚配,降低FH發(fā)病率有重要意義。