家庭醫(yī)學(xué)百科-自救互救篇:第九章　巨細(xì)胞病毒感染癥

第四節(jié)　發(fā)病機(jī)理

初次感染后，CMV將在宿主細(xì)胞中無限期存在成潛伏狀態(tài)�？赡芾奂岸喾N組織器官，尸檢提示肺、肝、胰、唾液腺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及腸也可能是病毒潛伏場所。先天性感染的嚴(yán)重程度，與缺乏產(chǎn)生沉淀抗體的能力和T細(xì)胞對CMV的應(yīng)答有關(guān)。兒童和成年人感染CMV后，在外周血中出現(xiàn)具有抑制細(xì)胞毒表型的活化T淋巴細(xì)胞，如果宿主的T細(xì)胞功能受損，潛伏的病毒就可能復(fù)活并引起多種癥候群。組織移植后發(fā)生的慢性刺激，為CMV活化，誘發(fā)疾病提供了條件。某些針對T細(xì)胞的強(qiáng)烈免疫抑制劑如抗胸腺細(xì)胞球蛋白，與臨床CMV癥候群高發(fā)率有關(guān)。此外，CMV在功能上可作為輔助因子，使?jié)摲�感染的HIV活化。

第五節(jié)　免疫學(xué)

CMV感染可引起機(jī)體的免疫功能降低，特別是細(xì)胞免疫功能下降。CMV感染對胸腺發(fā)育及脾細(xì)胞、單核吞噬細(xì)胞、NK細(xì)胞及CTL細(xì)胞的功能有著顯著的影響。

一、對胸腺、脾臟的影響

實驗室急性CMV感染的新生豚鼠，胸腺發(fā)育受抑，T細(xì)胞數(shù)減少，成年鼠感染CMV后，88%胸腺可檢出CMV。

CMV感染致脾功能受影響，脾臟淋巴細(xì)胞對conA刺激的增殖下降，脾細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2顯著降低。

二、對免疫細(xì)胞的影響

CMV感染引起的免疫抑制與病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制有關(guān)。CMV可以在單核吞噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞及一些尚未確定的單核細(xì)胞中復(fù)制，其中單核吞噬細(xì)胞最易感染CMV，淋巴細(xì)胞在免疫反應(yīng)中具有重要的調(diào)節(jié)功能和效應(yīng)功能。CMV感染后，可引起淋巴細(xì)胞的多種免疫功能受損。

CMV感染多表現(xiàn)為急性單核細(xì)胞增多癥。外周血淋巴細(xì)胞對有絲分裂原、CMV抗原和HSV抗原增殖反應(yīng)減弱，誘導(dǎo)干擾素水平下降，CD4/CD8比值從1.7±0.7下降為0.2+0.2,T細(xì)胞活性降低.這種變化有的可持續(xù)相當(dāng)長時間,病后10個月，大多數(shù)患者T細(xì)胞亞群比例仍未完全恢復(fù)正常。

CMV感染的免疫抑制作用主要是被病毒感染的大單核細(xì)胞和CD8細(xì)胞的功能異常所致。單核吞噬細(xì)胞在抗CMV免疫中起著樞紐作用，不但可以直接吞噬、殺傷病毒，更重要的是可以處理、提呈抗原，分泌細(xì)胞因子，調(diào)控和擴(kuò)大免疫反應(yīng)。當(dāng)CMV感染后，單核吞噬細(xì)胞功能受到影響，CMV感染巨噬細(xì)胞引起其吞噬功能降低，細(xì)胞內(nèi)氧自由基產(chǎn)生減少，F(xiàn)C受體、補(bǔ)體受體的表達(dá)發(fā)生改變，且其抗原提呈功能降低，產(chǎn)生IL-1降低，對IL-1及IL-2的反應(yīng)亦降低。Moses等用胸腺細(xì)胞增殖試驗檢測，IL-1活性降低，IL-1產(chǎn)生降低可引起TH/TS細(xì)胞比例失衡。

NK細(xì)胞有拮抗CMV擴(kuò)散的作用。NK細(xì)胞積極參與了抗CMV感染的全過程，但存在高的NK活力不一定是保護(hù)性應(yīng)答，而是活動性感染的證明。NK細(xì)胞雖不能阻止原發(fā)性CMV感染的出現(xiàn)，但一旦存在感染后，NK細(xì)胞能在CMV感染早期出現(xiàn)，有限制擴(kuò)散、使感染局限的作用。NK細(xì)胞、CTL細(xì)胞是抗CMV的重要效應(yīng)細(xì)胞。在CMV復(fù)制早期，感染性病毒體產(chǎn)生前，它們能裂解感染細(xì)胞，使病毒在細(xì)胞間擴(kuò)散流產(chǎn)。在小鼠模型中，病毒作用了3-5天時，抗病毒效應(yīng)由NK細(xì)胞介導(dǎo)，NK細(xì)胞活性可由IFN增強(qiáng)。6-21天，脾、外周血存在CTL細(xì)胞的殺傷活性。NK細(xì)胞、CTL細(xì)胞活性的高低決定了機(jī)體對CMV感染的敏感性及感染恢復(fù)的難易性。但CMV感染時，NK細(xì)胞及CTL細(xì)胞活性亦受到嚴(yán)重影響。此外，特異性細(xì)胞免疫有阻止CMV感染再發(fā)作用。有人檢測了20個發(fā)生CMV感染腎移植受者T細(xì)胞應(yīng)答，發(fā)現(xiàn)有14個有CMV細(xì)胞毒應(yīng)答，而6個不出現(xiàn)細(xì)胞毒應(yīng)答者有嚴(yán)重的臨床后果。因此，特異性T細(xì)胞存在，有阻止CMV感染再發(fā)的作用。

三、抗體有降低CMV感染的毒力作用

機(jī)體受CMV的感染后，可出現(xiàn)多種抗體。乳汁、宮頸分泌物、唾液中盡管有特異性抗體出現(xiàn)，包括中和抗體。但仍能檢出CMV，說明抗體并不能阻止病毒擴(kuò)散。胎兒從母體被動獲得的抗體不能阻斷經(jīng)宮內(nèi)、產(chǎn)道或乳汁傳播的感染。研究證明，致死性CMV攻擊前，在小鼠腹腔或靜脈注入0.2ml高效價抗CMV球蛋白，可完全保護(hù)動物免于死亡。1個月后再用CMV等二次攻擊，動物仍全部存活，表明抗體有降低CMV的毒力作用。

第六節(jié)　臨床表現(xiàn)

CMV感染的自然史很復(fù)雜，在原發(fā)性感染以后排毒，往往持續(xù)數(shù)周、數(shù)月甚至數(shù)年，然后感染轉(zhuǎn)為潛伏。常有復(fù)發(fā)感染伴重新排毒。甚至在原發(fā)感染后很多年，潛伏病毒再激活，也可能有不同抗原性病毒株的再感染。CMV感染的臨床表現(xiàn)與個體免疫功能和年齡有關(guān)。從表2所示，不論從垂直感染、平行傳播或醫(yī)源性感染所出現(xiàn)的癥狀與體征都是多種多樣的。

表2　CMV感染癥臨床經(jīng)過與病型（Baerlocher等)

關(guān)于后天性CMV感染癥，在臨床中常見于輸血后的單核細(xì)胞增多癥，由于免疫功能缺陷而發(fā)生血管、網(wǎng)膜炎、肺炎以及消化道感染。并且大多數(shù)患者合并格-巴氏綜合征。

第七節(jié)　診斷

單靠臨床表現(xiàn)不能診斷CMV感染，從臨床標(biāo)本中分離出病毒，同時抗體呈出4倍以上增加或持續(xù)抗體滴度升高，將有助于診斷。

一、病毒分離

最好用唾液、尿液、生殖道分泌物、乳汁和白細(xì)胞，接種到人的成纖維細(xì)胞內(nèi)繁殖和分離，細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE)在1天或數(shù)周后出現(xiàn)，經(jīng)固定和HE染色后可觀察到巨細(xì)胞，核內(nèi)有內(nèi)包涵體，核周暈圈及嗜酸性胞漿內(nèi)包涵體，很象“貓頭鷹眼”（owl′s eye)亦可用單克隆或多克隆抗體的熒光染色等方法檢查。

二、血清抗體檢測

最常用的有補(bǔ)體結(jié)合試驗（CF)、間接免疫熒光試驗（IIF)、免疫酶試驗（EIA)、間接血凝試驗（IHA)和放射免疫試驗（RIA)等檢測CMV-IgG和IgM抗體。當(dāng)單份血清標(biāo)本已確定既往有CMV感染時，應(yīng)當(dāng)立即留血清標(biāo)本，以及間隔2周、4周、8周再留血清標(biāo)本，結(jié)合病毒分離可作原發(fā)感染診斷。

三、DNA探針

已廣泛應(yīng)用于檢測CMV，其中以32P標(biāo)記的探針敏感性最高，對某些標(biāo)本來說，雜交方法可能比病毒分離更敏感。

四、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)

（一)標(biāo)本的采集及處理

采集的標(biāo)本包括患者的血液、尿，以及腺體組織等。由全血制備的血沉棕黃層（buffy coats)可保存于-80payment-defi.com/shouyi/℃；尿液標(biāo)本可保存于液氮中。凍存標(biāo)本應(yīng)避免反復(fù)凍融。

尿液標(biāo)本經(jīng)2500r/min離心10min，以除去細(xì)胞碎片，收集上清液。由于尿液中含有PCR抑制劑，因此需用聚乙二醇（PEG6000)進(jìn)行預(yù)處理：50μl尿上清與50μl 20%PEG6000和25μl 2mol/L NaCl混合，置冰浴中6h；15000r/min離心30min收集沉淀。再于6400r/min離心3min；盡可能吸去上清，將沉淀懸浮于蒸餾水中。該懸液可直接用于PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增時應(yīng)于100℃加熱10min，迅速置冰浴中冷卻。

（二)模板DNA的制備

1．由血液標(biāo)本制備模板DNA

方法A：向血清中加入NaCl使最終濃度為150mmol/L；取10μl 此血清于70℃處理45s后即可直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

方法B：由血沉棕黃層（BCP)制備：① 用PBS洗滌BCP兩次，收取沉淀。②加入500μl 6mol/L鹽酸胍，勻漿。③ 加入30μl 10mmol/l EDTA，10mmol/L NaCl，30μl20% Sarcosyl和5μl 蛋白酶K（10mg/ml)，混合均勻，60℃反應(yīng)1h。④加入1130μl 的乙醇，-20℃沉淀1～2h。⑤ 離心收集DNA沉淀。⑥用70%乙醇洗兩次，最后將沉淀懸浮于少量10mmol/L Tris-HCl，1mmol/l EDTA中。置4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.由冰凍組織標(biāo)本制備模板DNA：①用恒冷切片機(jī)切取一塊5～10μm冰凍組織塊，置于1.5ml塑料管中。②加入10%payment-defi.com/wsj/用緩沖液配制的福馬林。③ 10min后離心1～2min輕輕傾去上清液，沉淀用乙醇洗2次。④于室溫干燥10～60min。⑤ 加入抽提緩沖液（100mmol/L Tris-HCl，4mmol/l EDTA、pH8.0,400μg/ml蛋白酶K)，使剛好浸沒沉淀物（約50～100μl)；將沉淀搗碎。福馬林固定的或石蠟包埋組織經(jīng)脫蠟和干燥后也可按此處理。⑥37℃放置過液。⑦ 置沸水中7min滅活蛋白酶K。⑧離心收集上清，取1～10μl 即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

3.由尿液標(biāo)本制備模板DNA：①100μl 尿上清液與100μl 6mol/L異硫氰酸胍，7μl 2mol/LNaCl和20μl 玻璃粉懸液（DNa PREP，Asahi Glass Co，Tokyo)混合。② 室溫放置10min后，6400r/min離心2min，收集沉淀。③沉淀用50%乙醇，10mmo/L Tris-HCl、pH7.4, 50mmol/L NaCl洗一次，6400r/min離心1min。④同樣洗滌沉淀2次，收集沉淀。⑤ 加入50μl 蒸餾水，于55℃作用15min。⑥15000r/min離心2min，收集上清（含HCMV DNA)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將此懸液于100℃加熱10min，并迅速于冰浴中冷卻。

（三)引物及探針

引物及探針的設(shè)計是根據(jù)已發(fā)表的CMV的直接早期蛋白基因的啟動子區(qū)和開始的4個外顯子序列、晚期抗原gp64基因以及磷酸化蛋白pp71基因序列。常用的引物和探針列在表3中。

（四)PCR擴(kuò)增步驟

1．10×反應(yīng)緩沖液：100mmol/LTris-HCl、pH8.4，500mmol/l KCl，25mmol/L MgCl2，2mg/ml明膠。

Taq DNA 聚合酶：5U/μl 。

10×dNTP：4種dNTP各2.0mmol/L。

引物：100pmol/L。

2．常規(guī)PCR擴(kuò)增

10×反應(yīng)混合物（50μl)反應(yīng)緩沖液 5μl

10×dNTP　5μl

模板DNA　5μl

Taq DNA聚合酶　0.2μl (IU)

引物 各0.5μl

蒸餾水 3.8μl

加1～2滴礦物油。

將反應(yīng)混合物于94℃加熱5min；然后于95℃ 30s，55℃40s，72℃ 60s，擴(kuò)增35～40循環(huán)。

表3　CMV PCR擴(kuò)增所用的引物及探針

3．套式（nested)PCR擴(kuò)增：①反應(yīng)混合物的組成同（2)，僅引物為IE2a和IE4b（包括了整個外顯子3，共721b)，各100pmol。于94℃60s，52℃150s，72℃ 480s，擴(kuò)增20循環(huán)。② 取2μl 上述擴(kuò)增產(chǎn)物，各加100pmol的引物IE3a和IE3b補(bǔ)加其他試劑。然后，于94℃60s，52℃150s，72℃180s，擴(kuò)增20循環(huán)。

（五)產(chǎn)物鑒定

擴(kuò)增產(chǎn)物的分析可采用固相（濾膜)雜交和液相雜交試驗。

1． 固相雜交：

① 預(yù)雜交液為3×SSPE，5×Denhardt，0.5%SDS和25%甲酰胺.含有擴(kuò)增產(chǎn)物的濾膜于42℃預(yù)雜交30～60min。②加入標(biāo)記探針（10cpm/μg，2ng/ml)，雜交30～60min。③ 用0.2×SSPE,.01%SDS分別于室溫洗滌濾膜3次,5min/次;于60℃洗一次,10min/次;再于室溫洗一次以上,5min/次。④自顯影。

2． 液相雜交及電泳分析：

① 取1/10體積的擴(kuò)增產(chǎn)物與0.5～1.0pmol末端記的探針混合。②加入最終濃度為150mmol/L NaCl，10mmol/L磷酸鈉及1mmol/L EDTA溶液，使總體積為20μl 。③ 95℃ 10min，然后于56℃ 60min。④ 離心10s加入樣品緩沖液，于8%聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳。⑤電泳畢，用溴化乙錠染色，然后對X線片曝光，自顯影。

HCMV DNA分子很大，其堿基序列尚未全部搞清。雖然它的DNA的限制性內(nèi)切酶片段長度具多形性，但是對其基因組的離散性還不清楚。用單一引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可鑒定90%的HCMV野型分離株；而采用針對不同HCMV序列的兩套以上的引物對，則可檢測幾乎所有的病毒株。因此，可根據(jù)情況使用兩對或兩對以上的位于基因組不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR檢測。

在HCMV模板DNA制備過程中，有時會產(chǎn)生一些小片段DNA，在PCR反應(yīng)時常導(dǎo)致一定水平的本底產(chǎn)物，從而影響對結(jié)果的判定。在這種情況下可采用套式PCR法，其基本原理就是靶DNA的擴(kuò)增分為兩步：首先利用一對引物，擴(kuò)增包括靶DNA在內(nèi)的長片段DNA；然后取少量的擴(kuò)增產(chǎn)物，利用只針對靶DNA的引物再進(jìn)行第二次擴(kuò)增。通過控制每步中的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，即可防止由小片段DNA引起的假陽性。這種方法也可避免產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

PCR檢測HCMV標(biāo)本具有很高的敏感性。從HCMV感染的組織培養(yǎng)上清可檢測到相當(dāng)于幾十個病毒的DNA分子或1～5PFU病毒的DNA序列。用非放射性寡核苷酸探針進(jìn)行Southern雜交分析擴(kuò)增產(chǎn)物，可從尿液標(biāo)本中檢測到1pgHCMv DNA序列的水平；利用該系統(tǒng)，在4×104個細(xì)胞中只有一個病毒基因組即可檢測出，較斑點印跡雜交提高2×103倍。

PCR技術(shù)對HCMV感染的檢測具有臨床應(yīng)用價值，因為體液中病毒DNA先于病毒感染的臨床癥狀或血清學(xué)證據(jù)的出現(xiàn)，可作為HCMV感染的早期指標(biāo)。由于HCMV可通過胎盤內(nèi)感染、產(chǎn)道感染等途徑傳播，而且受感染的新生兒死亡率較高，因此利用PCR進(jìn)行早期診斷及采取及時的治療措施，對優(yōu)生優(yōu)育也有重要意義。利用這種方法，還可鑒定器官或組織移植手術(shù)中供體是否為HCMV與許多嚴(yán)重病癥的關(guān)系。再者，PCR檢測指標(biāo)穩(wěn)定，還可進(jìn)行半定量分析，因此可作為評價各種抗病毒藥物療效的手段。

第八節(jié)　治療

巨細(xì)胞病毒感染的治療，可應(yīng)用各種抗病毒制劑如GCV、抗巨細(xì)胞病毒的免疫球蛋白制劑、干擾素及轉(zhuǎn)移因子等。但這些藥物并不能解決根本問題，往往停藥后病毒又潛伏地回升，鑒于此種病毒可能作為艾滋病的病因之一，各國學(xué)者均在致力于控制其感染的研究。最近，美國學(xué)者研制出兩種活疫苗，初試后頗見效。一種是由AD169菌株研制成的；另一種是從TOWn菌株制成的，經(jīng)非腸道給藥后，已明顯表現(xiàn)出有抗巨細(xì)胞病毒的效能，CMV抗體升高，導(dǎo)致免疫功能增強(qiáng)。

醫(yī)學(xué)全在線 版權(quán)所有© CopyRight 2006-2046, MED126.COM, All Rights Reserved
皖I(lǐng)CP備06007007號