臨床生物化學:第三節(jié)　基因類腫瘤標志物的進展及其臨床應用

隨著分子生物學的理論和技術的發(fā)展，癌基因和抑癌基因的檢測已成為腫瘤臨床診斷新一代的標志物。

正常細胞的生長與增殖是由兩大類基因調(diào)控的，一類是正向調(diào)控信號，主要是起促進細胞生長和增殖，并且阻止其發(fā)生終末分化傾向，癌的基因起著這一方面的作用，另一類為負向調(diào)控信號，主要是使細胞成熟，促進終末分化，最后是細胞凋亡，抑癌基因則在這方面起作用。正常情況下這兩類信號保持著動態(tài)平衡，十分精確地調(diào)控細胞增殖和成熟。一旦這兩類信號中有一類信號過強或過弱均會使細胞生長失控而惡變。

一、癌基因

癌基因或腫瘤基因是指在自然或實驗條件下，具有潛在的誘導細胞惡性轉化的基因。在研究逆轉錄病毒時發(fā)現(xiàn)，將某些逆轉錄病毒的基因片段嵌入細胞基因中，并使這些基因迅速地表達，結果是被嵌入的細胞呈惡性轉變，特別是如果將這些逆轉錄病毒進入正常細胞染色體DNA的特定部位，就能很快地改變這些連接部位的基因表達，而使細胞癌變。從目前的資料分析（表8-9)，引起細胞惡變功能的基因已達30余種。

表8-9 常見癌基因類腫瘤標志物

（一)ras基因家族及其表達產(chǎn)物

1980年Langbcheim等通過基因轉染實驗發(fā)現(xiàn)了與Harvery及Kristein小鼠肉瘤病毒相似的細胞癌基因，即c-Ha-ras（1)基因，定位于第11號染色體的11p15區(qū)；c-Ha-ras（2)基因為偽基因（pseudogene)，定位于X染色體上；c-Ki-ras（1)基因為偽基因，定位于第6號染色體6p11-p12區(qū)。Ras基因編碼產(chǎn)物為p21^ras蛋白，其本質為膜相關的G蛋白，具有GTP酶的活化性，參與信號傳導。

當機體發(fā)生腫瘤時，編碼p21^ras蛋白的第12、13及61位氨基酸的核苷酸可以發(fā)生點突變，突變型的p21^ras蛋白不具有GTP酶活化，無法使GTP水解為GOP。另外尚可在腫瘤中發(fā)現(xiàn)p21^ras蛋白表達過度。

⒈可用于ras基因檢測的方法

⑴PCR-SSCP（單鏈構象多態(tài)性，singlestrandcomformatinpolymorphism)、DGGE（變性梯度凝膠電泳，denaturedgradientgelelectrophoresis)、PCR-ASO（等位基因特異性寡核苷酸雜交，allelespecificoligonucleotide)和測序技術（sequencing)：探測點突變。

⑵免疫組織化學：用RAP-5單抗。

⑶Southern印跡法及Northern印跡法。

⑷ELISA法及Western印跡法。

⒉ras基因家族與腫瘤的關系（表8-10)

表8-10 ras基因家族與腫瘤的關系

（二)myc基因家族及其表達產(chǎn)物

1997年Duesberg等發(fā)現(xiàn)myc癌基因與禽類MC29病毒具有相似性。Myc基因家族共有6成員：c-myc、N-myc、L-myc、P-myc、R-myc及B-myc。其中c-myc、N-myc及L-myc與一些人類腫瘤相關。c-myc定位于第8號染色體的8q24區(qū)，其編碼產(chǎn)物為439個氨基酸殘基的蛋白質。N-myc定位于第2號染色體的2p23-p24區(qū)，其產(chǎn)物為456個氨基酸殘基蛋白質。L-myc定位于第1號染色體的1p32區(qū)，編碼產(chǎn)物為364個氨基酸殘基的蛋白質。以上蛋白產(chǎn)物定位于核內(nèi)，為核轉錄調(diào)節(jié)因子，能夠與特殊的DNA順序結合，當機體發(fā)生腫瘤時，myc基因家族成員可以發(fā)生染色體基因易位、基因擴增以及表達過度。

⒈可用于myc基因檢測的方法

⑴標準細胞核型分析：基因易位。

⑵原位雜交：ELISA法。

⑶Southern印跡法及Northern印跡法。

⑷RT-PCR方法。

⒉myc基因家族成員與腫瘤的關系（表8-11)

表8-11 myc基因家族成員與腫瘤的關系

（三)表皮生長因子受體

1984年Downward研究發(fā)現(xiàn)表皮生長因子受體與C-erb-B具有相似順序，首先提出具有致癌潛能。

EGFR基因定位于第7號染色體上，編碼產(chǎn)物為P170的糖蛋白，屬于受體型酪氨酸蛋白激酶，能夠與表皮生長因子及其他配基結合。當機體發(fā)生腫瘤時，往往發(fā)現(xiàn)EGFR的過度表達。

⒈可用于EGFR的檢測方法

⑴競爭配基結合分析（competitiveligand-bindingassay)。

⑵體內(nèi)顯象：用¹¹¹煙標記的針對EGFR的單克隆抗體。

⑶Northern印跡法及Western印跡法。

⒉表皮生長因子受體與腫瘤的關系（表8-12)EGFR的過度表達與許多臨床腫瘤

表8-12 表皮生長因子受體與腫瘤關系

密切相關，尚有研究表明與一些腫瘤的預后也有一定相關。

二、抑癌基因（suppressergene)

機體中有一類對正常細胞增殖起負調(diào)節(jié)作用的基因稱為抑癌基因（表8-13)。當這類基因丟失、失活或變異時，往往會促使細胞失控而呈惡性生長。

表8-13 常見抑癌基因類腫瘤標志物

（一)RB基因及其表達產(chǎn)物

1986年Friend等成功地克隆了RB基因。RB基因定位于第13號染色體的13q14區(qū)，共有27個外顯子，26個內(nèi)含子，DNA長度約200kb。其編碼的蛋白質產(chǎn)物為p110。

RB蛋白磷酸化為其調(diào)節(jié)細胞生長分化的主要形式，細胞G₁/S其RB蛋白磷酸化受周期依賴性激酶cdk2調(diào)節(jié)。在腫瘤細胞中突變的RB蛋白失去了同核配體結合的功能。當機體發(fā)生腫瘤時，RB基因的主要變化形式有：缺失、突變、甲基化、表達失活及與病毒和細胞癌蛋白結合引起功能性失活。

⒈可用于RB基因檢測的方法

⑴PCR-SSCP、DGGE、PCR-ASO及測序技術：檢測點突變。

⑵PR-PCR、PCR。

⑶PCR-RFLP限制片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism)。

⒉RB基因與腫瘤的關系

⑴RB基因突變約見于40％的視網(wǎng)膜母細胞瘤。

⑵RB基因還與成骨細胞肉瘤、軟組織肉瘤、小細胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、食管癌及膀胱癌有關。

⑶近期研究表明RB基因還與卵巢癌有關。

（二)p53基因及其產(chǎn)物

1981年Crawford等發(fā)現(xiàn)了p53基因，并認為其為癌基因。以后Hinds、Finlay等通過研究發(fā)現(xiàn)傳染了myc或ras癌基因的細胞中，若存在野生型p53基因，則出現(xiàn)生長抑制。因此提出p53基因屬于抑癌基因。

P53基因定位于第17號染色體17p13區(qū)，由11個外顯子和10個內(nèi)含子組成，編碼393個氨基酸殘基的蛋白質即p53蛋白。p53的功能為轉錄因子，生物學功能為G1期DNA損壞的檢查點。人類腫瘤中P53基因突變主要在高度保守區(qū)內(nèi)，以175、248、249、273、282位點突變率最高，不同種類腫瘤其突變類型不同。另外p53變化形式還有缺失、基因重排與腫瘤病毒癌蛋白結合而失活。

⒈可用于p53基因檢測的方法：同RB基因檢測方法。

⒉p53基因與腫瘤的關系（表8-14)

表8-14 p53基因與腫瘤的關系