在第十五章酶免疫測(cè)定中已敘述了斑點(diǎn)-ELISA和RIBA兩種斑點(diǎn)免疫結(jié)合試驗(yàn)，本節(jié)介紹的兩種方法（斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)和斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn))是在以上兩種方法的基礎(chǔ)上發(fā)展形成的，均以硝酸纖維素膜為固相載體，以免疫金為結(jié)合物。因其最大特點(diǎn)是簡(jiǎn)便快速，故統(tǒng)稱為快速斑點(diǎn)免疫結(jié)合試驗(yàn)。
斑點(diǎn)免疫滲濾試驗(yàn)的基本原理是：以硝酸纖維素膜為載體，利用微孔濾膜的可濾過性，使抗原抗體反應(yīng)和洗滌在一特殊的滲濾裝置上以液體滲濾過膜的方式迅速完成。斑點(diǎn)免疫滲濾試驗(yàn)最初是從斑點(diǎn)ELISA基礎(chǔ)上發(fā)展起來建立的，應(yīng)用的結(jié)合物是酶標(biāo)記的，稱為斑點(diǎn)酶免疫滲濾試驗(yàn)。90年代初發(fā)展了以膠體金為標(biāo)記物的斑點(diǎn)免疫滲濾試驗(yàn)（dotymmunogoldfiltrationassay，DIGFA)，又名滴payment-defi.com/shouyi/金免疫測(cè)定法（簡(jiǎn)稱滴金法)。在滴金法中不需酶對(duì)底物的反應(yīng)，更加簡(jiǎn)便、快速，在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用日漸廣泛。
（一)原理
以雙抗體夾心法為例。在硝酸纖維素膜的膜片中央滴加純化的抗體，為膜所吸附。當(dāng)?shù)渭釉谀ど系臉?biāo)本液體滲濾過膜時(shí)，標(biāo)本中含抗原被膜上抗體捕獲，其余無關(guān)蛋白等沒濾出膜片。其后加入的膠體金標(biāo)記也在滲濾中與已結(jié)合在膜上的抗原相結(jié)合。因膠體金本身呈紅色，陽性反應(yīng)即在膜中央顯示紅色斑點(diǎn)。
（二)試劑和操作
1．滲濾裝置滲濾裝置是滴金法測(cè)定中的主要試劑成分之一，由塑料小盒、吸水墊料和點(diǎn)加了抗原或抗體的硝酸纖維素膜片三部分組成。塑料小盒可以是多種形狀的，盒蓋的中央有一直徑約0.4～0.8cm的小圓孔，盒內(nèi)墊放吸水墊料，硝酸纖維素膜片安放在正對(duì)盒蓋的中央有一直徑約0.40.8cm的小圓孔，盒的墊放吸水塑料，硝酸纖維素膜片安放在正對(duì)盒的圓孔下，緊密關(guān)閉盒蓋，使硝酸纖維素膜片貼緊吸水墊料。如此即制備成一滲濾裝置（圖19-1)。塑料小盒的形狀最多見的是扁平的長方形小板，加之滴金法的整個(gè)反應(yīng)過程都是在滲濾裝置上進(jìn)行的，因此又常稱滲濾裝置為滴金法反應(yīng)板。
2．試劑盒組成滴金法試劑盒的三個(gè)基本試劑成分是滴金法反應(yīng)板、免疫金復(fù)合和洗滌液。為了提供質(zhì)控保證，用于抗原測(cè)定的試劑盒還應(yīng)包括抗原參照品，相應(yīng)的檢測(cè)抗體的試劑盒應(yīng)有陽性對(duì)照品。
3．測(cè)定操作以雙抗體夾心法為例，具體步驟如下：
（1)將反應(yīng)板平放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，于小孔內(nèi)滴加血清標(biāo)本1～2滴，待完全滲入。
（2)于小孔內(nèi)滴加免疫金復(fù)合物試劑1～2滴，待完全滲入。
（3)于小孔內(nèi)滴加洗滌液2～3滴，待完全滲入。
（4)判讀結(jié)果：在膜中央有清晰的淡紅色斑點(diǎn)顯示者判為陽性反應(yīng)；反之，則為陰性反應(yīng)。斑點(diǎn)呈色的深淺相應(yīng)地提示陽性強(qiáng)度。
（三)質(zhì)量控制
滴金法的質(zhì)量控制常采用在硝酸纖維素膜上點(diǎn)加質(zhì)控點(diǎn)的方法。質(zhì)控小圓點(diǎn)多位于反應(yīng)斑點(diǎn)的正下方。雙抗體夾心法的質(zhì)控點(diǎn)最好是相應(yīng)抗原，若該抗原試劑不易制備或價(jià)格昂貴時(shí)，也可用SPA或針對(duì)金標(biāo)抗體的抗抗體來充當(dāng)。間接法的質(zhì)控點(diǎn)采用鹽析法粗提的人IgG最為經(jīng)濟(jì)、方便。
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圖19-1 DIGFA滲濾裝置及操作示意圖
A：操作示意圖B:裝置分解圖
有將包被斑點(diǎn)由圓點(diǎn)改成短線條式的：質(zhì)控斑點(diǎn)橫payment-defi.com/job/向包被成橫線條，如“－”；反應(yīng)斑點(diǎn)縱向包被成豎線條，如“∣”；兩者相交成“＋”。這樣，陽性反應(yīng)結(jié)果在膜上顯示紅色的正號(hào)（＋)，陰性反應(yīng)結(jié)果則為負(fù)號(hào)（－)，目視判斷直觀、明了。
（一)原理
斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn)（dotimmunochromatographicassay，DICA)簡(jiǎn)稱免疫層析試驗(yàn)（ICA)，也以硝酸纖維素膜為載體，但利用了微孔膜的毛細(xì)血管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲移，猶如層析一般。
（二)試劑和操作
免疫層析試驗(yàn)以單克隆雙抗體夾心法為例。試驗(yàn)所用試劑全部為干試劑，多個(gè)試劑被組合在一個(gè)約6mm×70mm的塑料板條上，成為一單一試劑條（圖19-2)，試劑條上端（A)和下端（B)分別粘貼吸水材料，免疫金復(fù)合物干片粘貼在近下端（C)處，緊貼其上為硝酸纖維素膜條。硝酸纖維素膜條上有兩個(gè)反應(yīng)區(qū)域，測(cè)試區(qū)（T)包被有特異抗體，參照區(qū)（R)包被有抗小鼠IgG。
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圖19-2 免疫層析試驗(yàn)原理示意圖
測(cè)定時(shí)將試紙條下端浸入液體標(biāo)本中，下端吸水材料即吸取液體向上端移動(dòng)，流經(jīng)C處時(shí)使干片上的免疫金復(fù)合物復(fù)溶，并帶動(dòng)其向膜條滲移。若標(biāo)本中有待測(cè)特異抗原，其時(shí)可與免疫金復(fù)合物之抗體結(jié)合，此抗原抗體復(fù)合物流至測(cè)試區(qū)即被固相抗體所獲，在膜上顯出紅色反應(yīng)線條（T)。過剩的免疫金復(fù)合物繼續(xù)前行，至參照區(qū)與固相小鼠IgG結(jié)合（免疫金復(fù)合物中的單克隆抗體為小鼠IgG)，而顯出紅色質(zhì)控線條（R)。反之，陰性標(biāo)本則無反應(yīng)線條，而僅顯示質(zhì)控線條。
斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn)在試劑形式和操作步驟上較前述的幾種免疫測(cè)定法都更為簡(jiǎn)化，只用一個(gè)試劑，只有一步操作。
上述兩種試驗(yàn)的共同特點(diǎn)是：簡(jiǎn)便、快速、單份測(cè)定、可立等結(jié)果，除試劑外無需任何儀器設(shè)備，且試劑穩(wěn)定。因此特別適用于急診檢驗(yàn)。但這類試驗(yàn)不能準(zhǔn)確定量，所以主要限于檢測(cè)正常體液中不存在的物質(zhì)（例如診斷傳染病中的抗原或抗體)以及正常含量極低而在特殊情況下異常升高的物質(zhì)（如HCG等)。目前臨床檢驗(yàn)中已開展的項(xiàng)目有HCG、抗HCV和抗HIV等。新項(xiàng)目正在不斷發(fā)展中。
