斑點-ELISA（dot-ELISA)的特點時：①以吸附蛋白質(zhì)能力很強的硝酸纖維素膜為固相載體；②底物經(jīng)酶反應(yīng)后形成有色沉淀，使固相膜染色。在實驗室中斑點-ELISA可按下法進行。在硝酸纖維膜上用鉛筆劃成4mm×4mm的小格，在每格中央點加抗原1～2μl，成為一個小點。干燥后將每格剪下分別放入ELISA板孔中，按ELISA方法操作，最后加入能形成不溶性有色沉淀的底物，如在膜上出現(xiàn)染色斑點，即為陽性反應(yīng)（圖15-11)。因硝酸纖維素膜吸附性能強，一般在包被后須再進行封閉。如將硝酸纖維素膜裁剪成膜條，并在同一張膜條上點有多種抗原，將整個膜條與同一份血清反應(yīng)，則可同時獲得對多種疾病的診斷結(jié)果。斑點-ELISA的缺www.med126.com點是操作麻煩，特別是洗滌的操作很不方便。
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圖15-11 斑點-ELISA示意圖
應(yīng)用斑點-ELISA的原理，通過特殊工藝已制備出各種試劑，供臨床檢驗用。一般分三種類型：①將試劑膜粘貼在塑料條片，便于洗滌和觀察。②將試劑膜封在小盒內(nèi)，膜下墊吸水劑，洗滌液通過膜吸入盒內(nèi)。此即斑點免疫滲濾試驗（見第十九章)。③將試劑膜固定在小杠框格中放入特殊的自動分析儀中檢測。應(yīng)用這一系統(tǒng)可做各種蛋白質(zhì)、激素、藥物和抗生素的定量測定。
免疫印跡法（immunoblottingtest，IBT)亦稱酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印斑法（enzymelinkedimmunoelectrotransferblot，EITB)，因與Southern早先建立的檢測核酸的印跡方法Southernblot相類似，亦被稱為Westernblot。免疫印跡法（圖15-12)分三個階段進行。第一階段為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)�？乖鹊鞍讟悠方�(jīng)SDS處理后帶陰電荷，在聚丙烯胺凝膠中從陰極向陽泳動，分子量越小，泳動速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見（只有在染色后才顯出電泳區(qū)帶)。第二階段為電轉(zhuǎn)移。將在凝膠payment-defi.com/sanji/中已經(jīng)分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓（100V)和大電流（1～2A)，通電45min轉(zhuǎn)移即可完成。此分階段分離的蛋白質(zhì)條帶肉眼仍不可見。第三階段為酶免疫定位。將印有蛋白質(zhì)條帶的硝酸纖維素膜（相當于包被了抗原的固相載體)依次與特異性抗體和酶標第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應(yīng)底物，使區(qū)帶染色。常用的HRP底物為3，3＇-二氨基聯(lián)苯胺（呈棕色)和4-氯-1-萘酚（呈藍紫色)。陽性反應(yīng)的條帶清晰可辨，并可根據(jù)SDA-PAGE加入的分子量標準，確定各組分的分子量。本法綜合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特異性和敏感性，是一個有效的分析手段，不僅廣泛應(yīng)用于分析抗原組分及其免疫活性，并可用于疾病的診斷。在艾滋病病毒感染中此法作為確診試驗�？乖�(jīng)電泳轉(zhuǎn)移在硝酸纖維素膜上后，將膜切成小條，配合酶標抗體及顯色底物制成的試劑盒可方便地在實驗室中供檢測用。根據(jù)出現(xiàn)顯色線條的位置可判斷有無針對病毒的特異性抗體。
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圖15-12 免疫印跡法原理示意圖
重組免疫結(jié)合試驗（recombinantimmunlbindingassay，RIBA)是與免疫印跡法的方法，不同之處在于特異性抗原不通過電泳分離轉(zhuǎn)印，而是直接分條加在固相膜上。RIBA已用于血清抗HCV抗體的測定和分析。HCV抗原成分復(fù)雜，包括有特異性的非結(jié)構(gòu)區(qū)抗原、結(jié)構(gòu)區(qū)抗原、核心抗原和非特異性的G抗原。在ELISA中一般使用混合抗原包被，檢測到的血清抗體是綜合性的。RIBA將各種抗原成分以橫線條式分別吸附在硝酸纖維素膜的膜條上，放于特制的長條凹槽反應(yīng)盤中與標本（一抗)和酶標二抗溫育和洗滌，最終加底物顯色后，顯色條帶提示血清中存在有針對這一吸附抗原的特異性抗體。根據(jù)條帶的粗細和顯色深淺，還可粗略估計抗體效價。
RIBA十分適合于含復(fù)雜抗原成分的病原體抗體的分析，除抗HCV外，也成功地用于抗HIV抗本的測定。
