自Gall和Pardue建立了原位雜交技術(shù)以來近20余年內(nèi)，這一技術(shù)為基因的定位和表達、基因進化、發(fā)育生物學(xué)、腫瘤學(xué)、微生物學(xué)、病毒學(xué)、醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和遺傳分析等領(lǐng)域研究提供了極其寶貴的資料，發(fā)揮了其它技術(shù)難以取代的作用。近年來，此一技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域逐漸擴大并在兩個主要進行了技術(shù)法的改進。一方面是應(yīng)用一系列放大手段增強檢測的靈敏度（詳見二十二章 )，另一方面是提高其分辨率，即向電鏡水平發(fā)展。Jacob（1971)首先用3H標(biāo)記的核酸RNA探針與DNA雜交并在電鏡水平顯示獲得成功，繼后不少科技工作者在這方面做了大量的工作（Manning et al 1975,Steinert et al1976,Hutchison et al 1982)。但所應(yīng)用的均是同位素標(biāo)記核酸探針，直到1986年Binder首先用生物素標(biāo)記的rDNA及UI探針，在蜂蠅（Drosophila)卵巢，應(yīng)用Lowicryl-K4M低溫包埋的切片上進行原位分子雜交，以蛋白A和膠體金復(fù)合物作為顯示系統(tǒng)，較好的保存了組織的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)和較高的信噪比例。Webster等人（1986)應(yīng)用生物素標(biāo)記探針顯示了細胞內(nèi)mRNA的分布。Singer等（1989)成功的用雙標(biāo)記原位雜交技術(shù)，一方面檢測整裝抽提細胞內(nèi)與骨架結(jié)合的mRNA，同時顯示了該mRNA所表達的蛋白質(zhì)。新近Fischer等利用地高辛標(biāo)記rRNA探針在Lowicryl-K4M包埋的切片進行雜交，然后以抗地高辛等抗體結(jié)合膠體金顆粒進行顯示，以銀顯示法加強獲得極為滿意的定位。總之，電鏡水平的原位分子雜交技術(shù)在國外還處在不斷提高和改進的階段，在國內(nèi)此一技術(shù)還剛起步。焦仁杰等（1992)報告了以生物素標(biāo)記腺病毒的基因組探針與整裝抽提的細胞進行電鏡原位雜交技術(shù)，成功地證明了腺病毒DNA與核骨架的緊密結(jié)合關(guān)系，膠體金顆粒呈簇狀與串珠狀結(jié)合在核骨架上。向正華等（1994)應(yīng)用地高辛標(biāo)記探針結(jié)合HRP的包埋前染色法顯示了POMc mRNA定位于神經(jīng)元的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。下面列舉幾種代表性的電鏡原位雜交技術(shù)。
（1)將整封染色體鋪片放置于金網(wǎng)上，在70%的酒精蒸汽固定4～15h，空氣干燥。
（2)以強堿使DNA變性，將金網(wǎng)置于2×SSC內(nèi)（應(yīng)用0.1n NaOH調(diào)整至pH12)，室溫，2min。
（3)脫水，以70%和95%酒精各沖洗3次，空氣干燥。
（4)雜交，金網(wǎng)覆于平面玻璃皿（ Petri dish)內(nèi)的雜交液滴上，每滴約10～15μl，將此小碟置于盛于雜交緩沖的大塑料盒內(nèi)，保持濕潤，在60～65℃孵育4～24h。
雜交液的配制：6×SSC或6×TNS（1×TNs =0.1mol/L NaCl,0.01mol/L Tris,Ph6.8,含30000～50000cpm/10μl3h cRNA)。
（5)雜交后沖洗，金網(wǎng)自雜交液中取出后立即用大量的2×SSC沖洗多次。RNA酶溶液（20μg/ml)室溫沖洗，然后再用2×SSC室溫沖洗，沖洗后梯度酒精脫水（70%，95%)空氣干燥。
（6)浸入乳膠膜，應(yīng)用L-4核乳膠液，水稀釋4倍。浸膜后的金網(wǎng)，用膠帶固定在載玻片上放在密封的黑色塑料盒內(nèi)，4℃，時間根據(jù)同位素種類和靶mRNA含量而定，也可選擇不同時間曝光，根據(jù)顯影強弱確定最終顯影的時間。
（7)顯影。暗盒自冷房或冰箱中取出后，在室漸中回暖至少30min，以防核乳膠膜皺縮。然后在顯影液（Kodax Microdol X)顯影3～5min，溫度18～24℃。水沖，在15% Kodax快速定影液定影5min，然后在空氣中干燥。
所有溶液應(yīng)盡可能新鮮配制。
（8)電鏡觀察。
（一)基本原理
應(yīng)用DNA探針缺口翻譯（nick translation)方法，通過堿基配對以一條DNA鏈為模板，將生物素標(biāo)記的某一種脫氧三磷酸核苷酸如Bio-dUTP滲入有缺口的DNA鏈。將生物素標(biāo)記的DNA探針與細胞或組織進行原位雜交。顯示方法有二種：一種是用HRP顯示，類似免疫電鏡技術(shù)中采取的包埋前染色法，利用地高辛-過氧化物酶HRP顯色法進行光鏡水平的厚片原位雜交免疫細胞化學(xué)染色，其步驟與第二十章 敘述的原位雜交免疫細胞化學(xué)基本方法相同，只是為了減少細胞微細結(jié)構(gòu)的損傷，在包埋過程中減少H2O2和Triton X-10等易損傷細胞與組織結(jié)構(gòu)的試劑用量（向正華等1993)。在顯色完畢后，取反應(yīng)陽性部位按常規(guī)電鏡操作程序進行鋨酸后固定，脫水，包埋，切片和觀察。此法利用HRP免疫反應(yīng)產(chǎn)物具有極高電子反應(yīng)密度體積大小不一，加之非特異性反應(yīng)產(chǎn)物常掩蓋微細結(jié)構(gòu)的背景，不易達到準(zhǔn)確的定位�，F(xiàn)在比較廣泛應(yīng)用的是生物素-蛋白A（PA)膠體金（gold)標(biāo)記技術(shù)。用于原位雜交的電鏡定位，取得較為滿意的效果。其基本原理是利用生物素標(biāo)記探針與細胞或組織進行原位雜交后，利用抗生物素抗體-結(jié)合蛋白A-金標(biāo)記雜交體的超微結(jié)構(gòu)定位，類似免疫電鏡中的包埋后染色。在包埋劑應(yīng)用方面，有報告應(yīng)用環(huán)氧樹脂包埋獲得成功的。但大多數(shù)較滿意的結(jié)果均獲自低溫親水性包埋劑——Lowicryl-K4M，也有應(yīng)用LR-white作為包埋劑的（詳見第七章 )。
（二)應(yīng)用生物素標(biāo)記DNA探針-PA-gold電鏡雜交技術(shù)（Binder et al,1986)
1．固定現(xiàn)認為應(yīng)用4%多聚甲醛加0.1%戊二醛在磷酸緩沖液中（pH7.4)，為較理想的固定劑，也有主張單純用4%多聚甲醛的，因經(jīng)實驗證明如應(yīng)用高濃度4%的戊二醛比用多聚甲醛樣品其雜交率減低60%。但作者認為應(yīng)用少量戊二醛可較好的保持細胞的微細結(jié)構(gòu)。也有報告用酒精/醋酸混合液的。多聚甲醛-戊二醛固定時間在15min至1h。然后放入Ringer氏液或PBS，在4℃含7%蔗糖的0.15mol/L磷酸緩沖液中儲存過夜。
2．脫水次日，用0.15mol/L磷酸緩沖液（pH7.4)沖洗30min，然后進行脫水，①65%乙二醇，0℃，60min；②80%乙醇-35℃，120min；③100%K4M：80%乙醇 =1：1，-35℃，120min；payment-defi.com/wszg/④100%K4M：80%乙醇=2：1，-35℃，60min；⑤100%K4M -35℃，過夜。
3．包埋 按照Roth et al（1981)，組織塊包埋于盛有K4M的膠囊中，在-35℃紫外線燈（波長360nm)照射聚合24～48h。取出后置室溫，用紫外線燈繼續(xù)照射24h，使變硬易于進行超薄切片。膠囊短期可保存于室溫，如需長期保存，宜置于-70℃冰箱中，可保存近1年。
K4M配制（中等硬度)
交聯(lián)接劑（cross-linker)2.7mg
單體（monomer)17.3mg
引發(fā)劑（initiator)0.10mg
可根據(jù)硬度需要調(diào)整各化合物比例。增加交聯(lián)劑的量，組織塊的硬度增加。
4．切片超薄切片50～60nm，撈于有覆有Formavar和碳膜的鎳網(wǎng)上。
5．組織前處理和預(yù)雜交用含0.2mol/l Tris緩沖液的0.1mol/L甘氨酸（Ph7.4)沖洗15min，以除去醛類固定劑對雜交和檢測的影響，然后2×SSC沖洗15min，再用變性液（70%去離子甲酰胺，2×SSC)在65℃處理樣品5～10min，以達到變性的目的。變化后的樣品在預(yù)雜交液中（50%去離子甲酰胺，0.5mol/l NaCl, 10mmol/L Tris,1mmol/LEDTA,pH7.5)37℃預(yù)處理15min。
6．雜交鎳網(wǎng)載有切片面覆蓋于雜交液滴（約20μl)上，置于濕盒內(nèi)37℃，1～2h。雜交液成份與光鏡原位雜交免疫細胞化學(xué)相同（詳見第二十章 )，如為DNA探針須在沸水中先煮2～3min，以使之變性，然后迅速移至冰浴。
整個雜交過程須注意防止鎳網(wǎng)上的雜交液干掉。
7．雜交后漂洗
含50%甲酰胺的2×SSC液37℃30min
含50%甲酰胺的1×SSC液室溫30min
無甲酰胺的1×SSC液室溫20min
樣品置1×SSc 4℃過夜
0.01mol/LPBS(pH7.2) 室溫10min
4%BSA 封閉 15min
8．羊抗生物素IgG抗體（sigma)1：100（稀釋用PBS液：2%NaCl, 0.05% KCl, 0.05% KH2PO4,0.278% Na2HPO4,另加300mmol/L NaCl, 0.5% Triton X-100)室溫反應(yīng)2h。
9．含0.1% BSA的PBS液洗3×30min。
10．兔抗羊IgG的IgG相連10nm膠體金（Sigma)1：100（稀釋用1%BSA緩沖液：20mmol/l Tris –HCl, pH8.2,0.9% NaCl,0.02mol/L疊氮鈉，0.5%Triton X-100),室溫反應(yīng)1h。
11．1%BSA緩沖液3×30min，PBS（pH7.2)15min，蒸餾水洗5min，空氣干燥。
12．醋酸雙氧鈾染色20min，檸檬酸鉛染色15min，空氣干燥后電鏡觀察。
應(yīng)用本法標(biāo)記有如下優(yōu)點：（1)可獲迅速的信號檢測；（2)形態(tài)學(xué)保存較好；（3)與放射性同位素原位分子電鏡雜交技術(shù)的信/噪比例相近。是目前公認在電鏡水平應(yīng)用同位素標(biāo)記原位雜交技術(shù)較為理想的方法。膠體金顆粒電子密度高，明顯地區(qū)別于非特異性染色與污染，能達到較為滿意的超微結(jié)構(gòu)定位。本技術(shù)的難點在于：①實驗周期長；②親水性低溫包埋劑制作切片，由于親水性強，撈取比較困難，切片易于破裂；③探針的純度與雜交后徹底的漂洗，這是本實驗成功的關(guān)系，而徹底的漂洗又易導(dǎo)致鎳網(wǎng)切片的破裂，作用推薦應(yīng)用大量漂洗液或漂洗中設(shè)置多個漂洗杯，勤換漂洗液，或用軟塑料瓶加筆狀噴頭，增加水壓等方法，但不論漂洗或噴水沖洗都必須注意水流與網(wǎng)面平行而不能垂直，否則更易導(dǎo)致切片的破裂。④雜交時間：Binder等證明雜交1h即可出現(xiàn)特異性，到5h之內(nèi)不斷增加。Lawrence和Singer（1985)實驗也表明雜交后3～4h雜交時特異性就可達到最大值，雖然此后雜交仍繼續(xù)進行，雜交率并不再增加。焦仁杰等（1992)對整裝細胞的試驗也與上述實驗相同，他們發(fā)現(xiàn)雜交4h和雜交20h相當(dāng)，但前者的結(jié)構(gòu)保存要好得多。他們實驗表明，切片標(biāo)本的雜交時間大約需9～10h。因此，選擇最短而又最有效的雜交時間對有效地保持形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)是十分重要的。Binder認為生物素PA-Gold電鏡雜交技術(shù)所需理想雜交時間為1～2h。⑤應(yīng)用含甲酰胺（formamide)的緩沖液漂洗易導(dǎo)致金粒聚集的非特異性背景，因此Binder在實驗后建議試用以PBS緩沖液漂洗5×10min代替含甲酰胺的鹽液，經(jīng)證明可避免或減少這種非特異性染色；⑥多數(shù)作者發(fā)現(xiàn)應(yīng)用K4M包埋劑在電鏡雜交技術(shù)是最理想的，其結(jié)果可與無包埋劑的培養(yǎng)細胞涂片、染色體鋪片等的信/噪比值相等。
雖然生物素-PA-Gold電鏡雜交技術(shù)在K4M包埋切片獲得了較為滿意的結(jié)果，但Lawarence和singer（1985)在比較了三種檢測系統(tǒng)的信/噪（signal/Noise,S/N)得到的結(jié)果是32P標(biāo)記為70、3H標(biāo)記為20、而生物素標(biāo)記的S/N值最低，為10。Webster等（1987)同時比較了生物素標(biāo)記P0-HRP糖蛋白cDNA探針（包埋前染色)和生物素標(biāo)記P0-糖蛋白cDNA探針-蛋白A-膠體金（包埋后染色)電鏡雜交技術(shù)，觀察15天大鼠三叉神經(jīng)節(jié) 雪旺氏細胞髓鞘的標(biāo)記，固定劑應(yīng)用PLA溶液（4%多聚甲，15%（V/V)飽和苦味酸)和0.08%戊二醛（用磷酸緩沖液配)，二者均獲顯示，但作者仍認為應(yīng)用PA-Gold電鏡雜交技術(shù)在K4M包埋切片上進行載網(wǎng)雜交的顯示結(jié)果以及形態(tài)保存更為理想。
（一)基本原理
在地高辛標(biāo)記核酸探針廣泛用于光鏡水平的原位雜交試驗并獲極為滿意的結(jié)果后，科學(xué)工作者試圖將其應(yīng)用于電鏡水平。其基本原理和生物素標(biāo)記核酸探針-PA-Gold電鏡雜交技術(shù)的基本原理相似，首先利用地高辛修飾核酸探針，與細胞或組織進行雜交，再用抗地高辛抗血清相連膠體金與之結(jié)合，進行細胞或組織特異核苷酸的超威結(jié)構(gòu)定位。為增強金的顯示效應(yīng)，可用銀加強法增強金粒的顯示效應(yīng)。
（二)基本操作方法（Fischer D et al, 1992)
1．組織處理
（1)固定：固定劑采用4%多聚甲醛（PFA，用PBS配制)加0.5%戊二醛（GA)，保存在4℃。作者采取浸入法，即取大鼠肝臟放入冷固定劑中（4%PFA，不含GA)，切成1mm3左右的小方塊。修整好的組織塊移入另一玻皿中，內(nèi)盛有4%PFA和0.5%GA,固定2h。
（2)PBS（4℃)漂洗3～5min。
（3)脫水
時間乙醇濃度溫度
2×15min 30%4℃
30min 30%4℃
30min 50% -20℃
2×30min 70%，90%，96%，100% -20℃
注意勿使酒精揮發(fā)致使組織干燥。
（4)浸透和包埋（Carlemalarm et al, 1989)：由于K4M包埋劑有揮發(fā)性，因此，此步操作者必須帶手套，在通風(fēng)柜中進行，注意K4M包埋劑不要靠近O2，一切在低溫下進行，最好設(shè)有恒低溫的冷柜。
①Lowcryl K4M配方
1)交聯(lián)劑A 2g
2)單體B 13g
3)引發(fā)劑0.075g
混合1)，2)后，再加“3)”輕攪勻，混勻后置于-20℃。
②浸透（infiltration)，在-20℃進行
時間液體
1h100%乙醇：K4M（1：1，V/V)
2×1h K4M
過夜 K4M
2×3h K4M
③包埋： 先將膠囊冷卻，滴入幾滴K4M，然后每個膠囊內(nèi)放入一個組織塊，以K4M充滿膠囊，在室溫放置30min，使包埋劑中氣泡逸出。然后置于0℃-40℃之間，利用紫外線燈360nm波長照射5天，溫度必須保存恒定。然后移至室溫使溫度回升，膠囊變硬。
④切片：由于膠囊是透明的，包埋在內(nèi)的肝組織很容易識別。修塊后進行切片，由于K4M是親水性的，在切片過程中注意組織塊表面一定不要讓水浸濕，用200個網(wǎng)眼的鎳網(wǎng)覆以For－mvar膜和碳膜撈取切片，空氣干燥備用于雜交。
2．探針準(zhǔn)備rRNA探針以Dig-UTP標(biāo)記，注意探針不宜過長，否則影響對組織的穿透性。如過長，可事先用第二十章 介紹的探針?biāo)夥ㄌ幚怼?/p>
3．雜交本步驟均在濕盒內(nèi)進行，將雜交液滴滴于蠟?zāi)ど�，將鎳網(wǎng)載有切片面覆于液滴上，在65℃雜交至少3h。雜交液含：5×SSC，0.1mg/ml tRNA,Dig-UTP反意探針10ng/μl(et 1×SSC配，含150mmol/L NaCl, 15mmol/L醋酸鈉)。
4．雜交后漂洗在室溫用2×SSC漂洗3×5min，然后用PBST（PBS,0.1%Tween)漂洗2×10min。
5．顯示
①以PBST加BT封閉（BT配方：PBST，1%BSA)孵育15min。
②應(yīng)用抗地高辛抗體結(jié)合直徑1mm的金粒，以PBST加BG稀釋為1：30，室溫孵育1h。
③以PBST漂洗3×5min。
④以帶筆尖嘴軟塑料壺沖洗6×15min。
⑤以銀增強法，在暗室中孵育于顯影液：促進液（Enhancer)1：1,4～20min。
⑥重復(fù)④。
⑦以2%醋酸鈾（4min)，枸緣酸鉛1min染色，漂洗，空氣干燥。
⑧電鏡觀察。
原位分子雜交技術(shù)在電鏡水平的應(yīng)用，或簡稱為電鏡原位分子雜交技術(shù)是基因表達在超威結(jié)構(gòu)定位的一項極有前景的新興技術(shù)。但要使之完善，還需要做許多工作。必須說明的是電鏡原位雜交技術(shù)和光鏡原位雜交技術(shù)一樣必須設(shè)置對照實驗組，對顯示的結(jié)果的解釋應(yīng)持審慎的態(tài)度。一般應(yīng)在重復(fù)多次實驗的基礎(chǔ)上才能得出對本實驗的結(jié)論，不能只憑一次實驗或一張電鏡照片就勿忙結(jié)論。因原位雜交技術(shù)是高度敏感、高度特異性技術(shù)，影響因素很多。電鏡原位雜交技術(shù)的影響和干擾因素更多。相信在不久的將來，隨著電鏡原位雜交技術(shù)的廣泛應(yīng)用，科技工作者將從實踐中對本技術(shù)的實驗流程不斷完善并有更多的新的電鏡原位雜交技術(shù)方法涌現(xiàn)。
