實用免疫細胞與核酸:第三節(jié)　DNA及寡核苷酸探針在原位雜交組織化學中的應用

一、DNA探針的應用

雖然一般認為DNA探針敏感度不如cRNA探針，但在病毒的檢測等領(lǐng)域中DNA探針仍得到廣泛的應用。

在原位雜交細胞化學的操作步驟方面與cRNA探針基本相同，所不同的是：（1)雜交時需先在高溫80～95℃短時處理，使DNA探針及細胞內(nèi)靶DNA變性，解離成單鏈，迅置于冰上冷卻。然后置于37℃～42℃雜交過夜。（2)RNA酶的溶液的沖洗不能減低背景，因此，在操作步驟中省略此步。

（一)地高辛-堿性磷酸酶（Dig -AKP)標記DNA探針在石蠟包埋切片檢測病毒DNA中的應用

1．組織前處理

（1)固定：組織以10%中性福爾馬林液或Bouins液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚4～6μm，粘附于涂有粘附劑的玻片上，入烤箱60～80℃6～8h，使切片更緊貼玻片。

（2)脫蠟：二甲苯10min×2，自100%乙醇，90%，70%，50%，30%各5min。入PBS（含5mmol/lMgCl₂,pH7.3～7.4)10min×2。入0.2n HCl 20min以進一步去除蛋白。

（3)50℃2×SSC，含5mmol/l EDTA溶液中30min。

（4)蛋白酶K（1μg/ml溶于0.1mol/l PBS中，)37℃20～25min。

（5)0.2mol/l 甘氨酸液：室溫10min，中止蛋白酶反應。

（6)4%多聚甲醛（PBS新鮮配制)：室溫20min。

（7)PBS/5mmol/lMgCl₂漂洗10min×2。

（8)脫水，自低濃度到高濃度，無水乙醇各3min，空氣干燥。

2．預雜交封閉非特異性雜交位點，20μl/每張切片，42℃水浴半小時。

3．雜交10～20μl/每張切片，加蓋硅化蓋玻片，將切片置于95℃min，使探針及病毒DNA變性，然后迅速置于冰上1min（也有報告用乙醇使之冷卻的)，然后將切片置于盛有2×SSC濕盒內(nèi)，42℃過夜（16～18h)。

4．雜交后漂洗

（1)2×SSC液內(nèi)振動移除蓋片。

（2)2×SSc55℃10min×2。

（3)0.5×SSc55℃5min×2。

（4)緩沖液II（含0.5%封阻試劑，用緩沖液I溶解)37℃30min。

（5)緩沖液I（10mmol/l Tris –HCpayment-defi.com/wszg/l, 15.0mmol/L NaCl pH7.5)15min，室溫。

（6)酶標地高辛抗體（1：5000，應用緩沖液I稀釋)37℃30min。

（7)緩沖液i15min×2室溫。

（8)緩沖液III（100mmol/l Tris -HCl, 100mmol/L NaCl, 50mmol/L MgCl₂,pH9.5)室溫2min。

5．顯色

（1)顯色液配制：緩沖液III：1ml中加入4.5μl四氮唑藍（NBT)，3.5μl X-磷酸鹽（5-溴-4-氯-3吲哚磷酸鹽（BCIP配成))。30μl/每張切片，置暗處顯色30min到2h。定時抽查切片，鏡檢其顯色情況。

（2)緩沖IV（10mmol/l Tris –HCl, 1mmol/L EDTA, pH8.0)10min終止反應，甲綠復染5min，二甲苯透明，DPX封固，鏡檢。

（二)熒光標記DNA探針的應用

1．概述在原位雜交細胞化學中熒光標記DNA探針（Fluorescence in situ DNA hybridisa－tion , FISH)的應用在細胞培養(yǎng)和染色體鋪片（見二十一章　)中較為廣泛。FISH屬于非放射性標記，其優(yōu)點在于簡便，快速，其敏感性可與放射性同位素標記核酸探針相等。不少實驗室報告應用FISH（2～5kbp探針)可成功地達到單個拷貝（copy)的特異性定位。

2．熒光標記DNA探針應用于ISHH中的基本原則（Barbara Traok和Dan Pinkel 1990)

（1)首先應使組織或染色體中靶核苷酸高溫加熱變性解離為單鏈DNA，化學性標記的DNA探針除外。

（2)雜交：一般在37℃進行，探針稀釋濃度在2ng/μl，染色體鋪片探針濃度在0.4ng/μl,雜交液2～3μl/每cm²蓋片，每張蓋片大約1.8cm²，約需10μl雜交液。有實驗室報告，如每張蓋片（溫度為室溫)加入雜交液將會降低雜交溫度所需要的37℃，因此，建議對蓋片應用前在37℃進行預熱。

（3)用免疫細胞化學或組織化學方法顯示熒光標記。自80年代以來，熒光素標記檢測系統(tǒng)日益增加。包括：①生物素標記探針與熒光素標記的抗生物素（avidin)或抗生物素抗體。②氨乙酰基熒光（aminoacetylfluroence,AAF)-改良探針（modified probe)，與抗AAF抗血清。③磺酸（sulfonatc)改良探針，以抗磺酸抗血清檢測（Organic Ltd, Yavene, Israel和TMc BioproductsRockland ME可提供此藥盒)。④汞標記探針（mercuratedprobe)，以硫氫基（sulf hydryl)與熒光標記物或-半抗原相結(jié)合，再以抗半抗原抗血清檢測。⑤地高辛標記探針，以地高辛抗血清檢測（Boehringer – ManubeimInc, Mannhein, FRG可提供此藥盒)。在上述各例中，為簡便可采用直接法（圖20-4A)，為提高敏感度可采用間接法（圖20-4B)。

圖20-4　生物素標記核酸探針熒光免疫反應圖解

生物素和地高辛用缺口平移法或隨機引物法進行標記，以用后者為多。氨乙酰熒光素，磺酸和汞的核苷酸探針標記利用簡單的化學反應。產(chǎn)生熒光的物質(zhì)各有不同，常用的有異硫氰酸熒光素（FITC)，也有應用德克薩斯紅（texaored)獲得滿意效果的。但藻紅素（Phycoerythrin)應用效果較差，可能由于分子大的緣故。可同時應用AAF和生物素標記系統(tǒng)及汞與生物素系統(tǒng)分別應用不同的熒光素去標記兩條DNA進行雙重染色。

3．基本操作方法

（1)玻片準備：細胞用甲醇：醋酸（3：1)固定，滴在玻片上可保存在-20℃，如將此載片烘烤于65℃數(shù)小時，將會導致樣品的人工老化。應用相差顯微鏡在低倍下定位最佳區(qū)域，或用嘴輕吹氣的方法可以看見浮動的細胞。在玻片背面圈出蓋片應覆蓋的區(qū)域。

（2)RNA酶處理：加50μlRNA酶溶液，蓋以蓋玻片，放在濕盒內(nèi)（2×SSC)37℃1h。應用2×SSC漂洗2×3min，室溫，梯度酒精脫水（70%，90%，100%)，在空氣中干燥。

（3)蛋白酶K和多聚甲醛處理：對單個拷貝雜交，蛋白酶K溶液（0.3～0.6μg/ml，在20mmol/l Tris –HCl, pH7.5, 2mmol/L CaCl₂)在37℃孵育2h。此法對甲醇-醋酸固定的淋巴細胞效果特佳，但這種濃度的蛋白酶K溶液對未事先經(jīng)多聚甲醛固定的染色體制片可在靶DNA變性步驟中完全破壞。因此，需根據(jù)細胞類型調(diào)整溶液的濃度和孵育時間。蛋白酶K消化后，以2×SSC，在室溫漂洗2min×3，再固定于4%多聚甲醛溶液中，室溫10min。2×SSC洗2min×3。

（4)靶DNA變性：將載片浸入70℃變性溶液（70%甲酰胺，2×SSC)2min。新鮮的變性溶液需每周配制，貯存于4℃冰箱中備用。一張?zhí)幱谑覝氐妮d片放入50ml的染色缸（coplin jar)內(nèi)，將會使溶液溫度減低約1℃，因此，每次應加入少量玻片，以免影響溶液的溫度致變性不完全。冷卻變性處理后的載片可放在冰上或浸入70%酒精溶液1min。漂洗加震動以終止反應和徹底去除變性溶液。然后經(jīng)梯度酒精脫水（80%，90%，100%)，空氣干燥。

（5)雜交液的準備

MM₁ 甲酰胺5.0ml

硫酸葡聚糖1.0g

20×SSC　1.0ml

（或50%硫酸葡聚糖)2.0ml

MM₂甲酰胺　5.5ml

硫酸葡聚糖1　.0gm

20×SSC　0.5ml

首先將溶液在70℃加溫，以溶解硫酸葡聚糖，冷卻后調(diào)整pH至7.0,容量加至70ml。這容量是最后應用的雜交混合液的70%，其余的30%為核酸探針和水（如果需要的話)。MM₁給預雜交混合液是：50%甲酰胺，10%硫酸葡聚糖2×SSC。Trask發(fā)現(xiàn)MM₂效果較MM₁好，DNA的Tm比MM₁低-8℃。在2×2cm區(qū)域雜交混合液應為：MM₁7μl，DNA探針（保存液為500μg～10mg/ml)1μl，加探針混合液2μl，總量為10μl。

（6)雜交：每張蓋玻片加10μl雜交混合液，注意移除氣泡，可在蓋片四周加橡皮泥封固，在37℃濕盒中過夜。

（7)漂洗：從溫箱中取出后，以鑷子移除橡皮泥，從現(xiàn)在起注意勿使載片干燥。否則鹽的晶體將產(chǎn)生非特異性背景染色，漂洗應用2×SSC（pH7)在45℃3min×3。不時震動以助徹底漂洗，蓋玻片將在漂洗中自然移除。然后再在2×SSC，45℃，2min×3。保存載片于PBS溶液內(nèi)。

（8)熒光顯示：

①生物素標記DNA探針的熒光顯示。

1)應用PBS含5%無脂干奶（5μl每張蓋片)，也可用1%牛血清白蛋白（BSA)-PBS覆蓋孵育5min室溫，以封閉非特異性結(jié)合部位。

2)移除多余液體，加抗生素-FITC（5μg/ml在PBS含5%奶粉或1%BSA，5μl/cm²)。在濕盒中，室溫孵育20min�？股�物素-FITC在此應用是過量的，因此，可回收貯存4℃再次應用，其保存時間可達數(shù)周。反應見圖20-4A直接法。

3)漂洗：PBs 2min×3，45℃。

4)如需放大（amplification),即提高其敏感度，可按圖20-4B間接法加生物素化羊抗抗生物素抗血清（biotinylated goat – antivaidin antibody)30min室溫。傾去加另一層抗生物素-FITC抗血清孵育20min，重復上述1)～3)。

②AAF標記核酸探針的熒光顯示

1)封閉非特異性結(jié)合部位：從PBS中取出載片，吸干多余液體，加PBS-0.1%吐溫（Tween)含2%正常羊血清（NGS)（5μl/每cm²蓋玻片)。使載片停留在室溫5min。

2)傾去多余液體，加抗-AAF抗血清1：750，PBS-Tween –NGS溶液（如上i)5μl/cm²蓋玻片。室溫37℃。孵育30min.

3)漂洗：PBS-0.1%Tween室溫5min×3，間歇性振蕩。

4)羊抗小鼠IgG-FITC孵育，1：300～1：1000在PBS-0.1%Tween含2%NGS，37℃孵育30min，如3)應用PBS-0.1%Tween 漂洗5min×3。

4．熒光標記DNA探針在細胞核混懸液雜交中的應用

（1)細胞核的分離：將培養(yǎng)的細胞制成細胞混懸液，或以胰蛋白酶消化法于培養(yǎng)蓋上收集培養(yǎng)細胞。應用MgSO₄染色分離方法分離細胞核（Van den Engh etal 1986, 在Traok和Van Den Engh 34章　)。細胞混懸液濃度為5×10⁶/ml。利用RNA酶消化后，使核從細胞分離，細胞核混懸液濃度為4～5×10⁶細胞核/ml。

（2)細胞固定和酸的處理：在5ml試管內(nèi)加冷的100%酒精不斷旋轉(zhuǎn)以達到滿意的固定。在冰上停留10min。在4℃離心（×150g)10min。重復加三次冷的100%酒精入試管內(nèi)，離心，傾去。置于冰上10min，再離心。然后加入相當核懸液1/2量的0.1n HCl , 0.5% Triton X-100。室溫停留10min。加入IBM-0.25%Triton X-100（IBM配方：50mmol/l KCl, 10mmol/L MgSO₄, 5mmol/L HEPES pH8.0)。再離心，重復IBM漂洗（這時細胞核可在不染色情況下，以熒光顯微鏡觀察)后，以2×SSC-0.1%Tween漂洗1×3min，繼之加入等量2%的多聚甲醛在1×PBS-5mmol/l MgSO₄。在室溫靜置站立10min。傾去上清液，加IBm -Triton X-100漂洗，離心，使細胞核混懸液最終濃度為10⁸/ml，（可用IBM-Triton X-100稀釋約50倍，在血球計數(shù)器計數(shù))，混懸液鏡檢應含單個，完整的細胞核。

（3)細胞核混懸液雜交

①配制雜交混合液：甲酰胺5份，20×SSC1份，50%硫酸葡聚糖2份，pH調(diào)至7.0。此原液（stocksolution)可貯存在4℃冰箱內(nèi)。應用時加1份10mg/ml鯡魚精子DNA（herringsperm DNA)。

②混合1μl的細胞核混懸液（10⁸/ml)與18μl的雜交混合液，充分混勻。將此19μl混合液移入1.5ml容積的Eppendorf管中（核含量約為10⁵)。

③加入100ng/每管的AAF標記DNA探針（如為生物素標記DNA探針濃度為20～40ng/每管)。

④置70℃10min使DNA探針和核DNA變性。

⑤和組織切片與DNA探針雜交方法相較，不同的是在加熱變性后切勿置冰上迅速冷卻以終止反應，而應迅速轉(zhuǎn)入37℃孵育過夜。

（4)雜交后漂洗

①在每管中加入1.25ml 50%甲酰胺-2×SSC（pH7.0)，在42℃靜置10～15min。偶爾旋轉(zhuǎn)以助混勻。冷卻至室溫。加100μl經(jīng)dimethylsuberimidate(DEMS)處理的血細胞（10⁷/ml)混勻，離心，室溫，10min，輕彈試管使沉淀的小塊散開，加入1.25ml 2×SSC(pH7.0)，42℃，繼之，靜置于室溫10～15min，如前離心，再加1.25mlIBM-Triton X-100,室溫靜置5min，離心。

注：DEMS處理紅細胞方法：經(jīng)漂洗并離心去除白細胞和血清的紅細胞在鹽液如PBS中，細胞含量為10⁸/ml，以K₂CO₃和DEMS溶液處理3次，第1次：K₂CO₃為20mmol/L,DEMS為3mmol/L，以后2次：K₂CO₃依然為20mmol/L，而DEMS為10mmol/L。在應用前將K₂CO₃和DEMS液混合加入紅細胞混懸液中。在最后2次漂洗液中，應用100mmol/l K₂CO₃將pH調(diào)至9～10。在25℃，15min后，加入50μl，100mmol/l 的檸檬酸（citric acid)/每ml細胞混懸液的濃度以達固定紅細胞的目的。固定的紅細胞離心傾去上清液后，用2×SSC稀釋到10⁸/ml，加0.1%疊氮鈉可在4℃保存至少1年。

（5)AFF標記的熒光顯示：加200μl的PBS含0.05%Tween和2%正常血清（NGS)，輕輕振蕩混勻，室溫靜置10min，加20μl 1：100的單克隆抗AFF抗體，37℃孵育45min，加1.25ml的PBS-Tween，室溫靜置10min，加20間歇性振蕩，離心，傾去上清液，加200μlPBS含0.05%Tween –2%NGS,振蕩，室溫靜置10min，加20μl的羊抗小鼠–FITC熒光標記抗血清，稀釋度1：100～1：300。孵育于37℃45min，加1.25mlPBS –Tween,室溫靜置10min，離心，傾去上清液。

（6)生物素標記探針的熒光顯示：加200μl 4×SSC含0.1%Trion X-100 和5%BSA。室溫靜置10min后，加20μl抗生物素標記FITC抗血清15μg/ml，孵育在37℃30min，以1.5ml 4×SSc –0.1% Trion X-100洗1次，加入1.25ml IBm –Triton X-100,室溫靜置10～15min，間歇振蕩、離心。

（7)熒光顯微鏡觀察：將細胞核混懸液稀釋于250μl的IBM-Trion X-100中，輕加振蕩混勻。為抗熒光褪色可加等量的抗褪色溶液至載片上的細胞核涂片上，選擇適當?shù)募ぐl(fā)波長觀察。

（8)流式細胞計：將750μl的細胞核混懸液通過流式細胞儀（Flow cytometry, FCM)，DEMS處理過的紅細胞作為對照（Df 530/30nm, Omega ·Optical Inc, Brattleboro, VT)。詳細操作見第十章　。

二、寡核苷酸探針的應用

寡核苷酸探針的優(yōu)點在于它能根據(jù)需要人工用DNA合成儀合成，其長度及分子大小比較一致，可以控制。其長度一般較克隆的DNA片段短。目前，寡核苷酸探針已能成功的為放射性同位素、熒光素、生物素和地高辛所標記，并成功地運用于培養(yǎng)細胞、組織切片和染色體鋪片等的原位雜交中。雖然有些科技工作者認為其敏感度不如來自質(zhì)粒擴增的cRNA或DNA探針，但由于探針payment-defi.com/shiti/制備簡便再加之于近年非放射性標記的成功，寡核苷酸探針在生物基礎(chǔ)醫(yī)學及臨床學科領(lǐng)域中得到較為廣泛的應用。

在原位雜交組織化學中應用寡核苷酸探針，其基本操作要點是相同的，如雜交溫度在Tm-25℃，雜交孵育時間以過夜（16h左右)為佳。應用寡核苷酸探針在原位雜交組織化學技術(shù)中的成功與否主要決定于探針的設(shè)計，使有效配對率增加而錯配（mismatch)減少。

（一)地高辛標記寡核苷酸探針的應用

1．組織處理

（1)冷凍切片：厚10～20μm，貼于事先經(jīng)清潔處理及涂有粘附劑的切片上。切片保存于-80℃，在應用于雜交實驗前，使迅速回升到室溫，干燥，固定于3%多聚甲醛-PBS溶液中，pH7.4。PBS漂洗5min×3，孵育在2×SSc10min。

（2)石蠟包埋切片：浸入二甲苯10min移除石蠟，以100%乙醇10min×2，空氣干燥10min，從高到低梯度乙醇（95%，80%，70%)1min/每個濃度。PBs 5min×3，孵育在2×SSc 10min。

（3)離心細胞涂片：將細胞先以4%多聚甲醛固定，應用離心沉淀法，將沉淀物涂于有粘附劑的載片上，應用PBS（含5mmol/l MgCl₂)5min×3漂洗。在0.1mol/L三乙醇胺含0.25%(V/V)乙酸酐10min。在0.2mol/l Tris –HCl 含（0.1mol/L甘氨酸)pH7.410min。孵育在2×SSc 10min。

2．探針準備35pmol的寡核苷酸（oligo -)探針，3’ 終末標記以地高辛-11–dUTP。

3．預雜交和雜交加約300μl預雜交液（配制法見附錄)在每張載片上，室溫孵育1h。如為鯡魚精子DNA，在應用前須在沸水浴中加熱10min，而對酵母tRNA可不用加熱變性。

（1)應用預雜交液稀釋地高辛標記的Oligo-探針，探針理想工作濃度根據(jù)于待測核苷酸含量和實踐的結(jié)果。如對于檢測大鼠垂體的前促黑激素（proopiomelanocortin,POMC)mRNA的Oligo –探針，其理想工作濃度為342ng/ml(0.342ng/μl)。

（2)預雜交后以2×SSC漂洗，以吸水紙拭干切片周圍水份，加30μl雜交液在切片上，加硅化蓋玻片，在37℃過夜。如探針大于36堿基則雜交溫度為42℃。次日室溫2×SSC液漂洗切片1h，1×SSC漂洗切片1h（室溫)，0.5×SSc 37℃漂洗半小時，0.5×SSC室溫漂洗半小時。

4．地高辛顯示（同前)。

（二)同位素標記寡核苷酸探針的應用

1．組織處理大鼠應用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛-磷酸緩沖液中，約2h后（也可置于4℃冰箱過夜)取腦浸于同樣固定液中加10%蔗糖溶液過夜，4℃。次日恒冷箱切片（-14℃)，厚14μm左右，貼于有粘附劑的載片上，37℃或室溫干燥以增加切片的粘附性。

2．雜交前處理同本章　第二節(jié)　放射性標記cRNA探針一節(jié)　。

3．雜交37℃過夜，余細胞同前。

4．雜交后漂洗2×SSc5min×3，1×SSc 1min室溫，0.5×SSc55℃15min×2，室溫漂洗于0.5×SSc 3min×2。梯度酒精脫水，切片室溫干燥。

5．浸核乳膠切片浸入核乳膠，黑盒封閉，在4℃曝光2～3周（視同位素種類)，顯影，復染，觀察。

（第二、三節(jié)　中所用試劑配制見附錄)。