1.
(1)取大白鼠的肝、腎、心、小白鼠胃,人甲狀腺,橫紋肌等單獨或制成復(fù)合冰凍切片(4~5μm,)。其中1片用56℃甲醇固定3min,另切一片不固定,分別放入濕盒中。
(2)將病人血清用0.01mol/l Ph7.2~7.4磷酸緩沖鹽水(PBS)作1:5稀釋,滴加覆蓋抗原切征,置濕盒中,37℃,30~60min。
(3)切片用PBS洗2次,每次5min。用電磁攪拌或振蕩幫助洗凈不參與反應(yīng)的血清蛋白。吹干。
(4)滴加抗人IgG或γ-球蛋白熒光抗體(用0.01%伊文氏藍稀釋)覆蓋切片,37℃中放置30min。
(5)用PBS洗2次,方法同步驟(3),隨后,再用蒸餾水洗1min。
(6)緩沖甘油(pH9.0~9.5,PBS或碳酸鹽緩沖液1份和1份甘油混合)封片。
2.對照試驗可作空白,替代,一步法抑制或吸收等對照,以證明陽性結(jié)果的特異性。
3.熒光顯微鏡檢查陽性熒光呈明亮的黃綠色熒光,抗原組織成分呈現(xiàn)出陽性熒光時,即證明病人有對該組織成分的自身抗體,如細(xì)胞核呈明亮的黃綠色熒光即報告抗核抗體陽性。對陽性結(jié)果根據(jù)需要可進一步作滴度檢查。
近來一些報告認(rèn)為用培養(yǎng)細(xì)胞作某些自身抗體檢查,可以取得良好的效果。
在檢查自身抗體中常?沙霈F(xiàn)某種非特異性熒光,如粘液腺分泌物,粘液細(xì)胞,白細(xì)胞,胃粘膜表現(xiàn)的食物殘渣,心肌異嗜性抗體反應(yīng)等,以及有時用大白鼠胃組織切片出現(xiàn)的壁細(xì)胞非特異熒光等,容易引起混淆。這些問題都可通過對照試驗(包括用正常人血清)和觀察者的經(jīng)驗加以排除。
4.結(jié)果報告根據(jù)熒光顯微鏡觀察的結(jié)果一是形態(tài)特征,二是熒光的亮度。在報告時先報告陽性熒光的形態(tài)名稱加抗體如抗核抗體,再描述熒光亮度,主要靠觀察者的主觀目測,可分陰性和陽性兩種結(jié)果,陽性又可分“+”為可見較弱的熒光,“++”為明亮的熒光,“+++”為耀眼的熒光。雖然這樣的目測記錄精確度可能在不同觀察者之間有差別,但經(jīng)過訓(xùn)練和有較多的觀察經(jīng)驗后,這種方法基本上是可靠的,也便于推廣應(yīng)用。
近年使用熒光顯微分光光度計和圖像分析儀等定量檢測方法,結(jié)果比較客觀,將結(jié)果打印報告更適合于臨床診斷和科學(xué)研究,應(yīng)爭取采用這些先進儀器和方法,改進結(jié)果的判斷,記錄和報告。
5.免疫酶組織化學(xué)檢測自身抗體方法免疫酶組織化學(xué)間接法可以代替免疫熒光法用于自身抗體的檢測,但尚未普遍采用。其優(yōu)點是可以用普通顯微鏡觀察結(jié)果,更適合于基層實驗室使用,標(biāo)本也可長期保存。
(1)抗原(與免疫熒光法相同)。
(2)操作方法:
①抗原切片先用0.01mol/L pH7.4PBS洗1次,吹干,放入濕盒中。
②滴加1:5稀釋的待檢血清,37℃,30min。
③PBS洗2次,每次5min,吹干。
④滴加適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)記A蛋白或抗人IgG抗血清,37℃,30min。
⑤用辣根過payment-defi.com/job/氧化物酶底物顯色(同前述免疫酶法),室溫10min。
⑥水洗。
⑦0.1%伊文氏藍或蘇木精染色5min。
⑧水洗,常規(guī)酒精脫水,透明封片。
結(jié)果:陽性為棕色,陰性為藍色。在第3步之后可用1%H2O2作用15min消除內(nèi)源酶干擾。
6.自身抗體的聯(lián)合檢測方法在血清中存在的多種自身抗體,可用多種組織抗原組合制作成復(fù)合抗原檢測?乖M成可包括以下組織:
(1)肝臟:①檢出抗核抗體;②抗肝細(xì)胞膜抗體;③抗膽管上皮細(xì)胞抗體;④抗核仁抗體等?捎么笫蠡蛐鼠肝組織。
(2)胃:①檢出胃壁細(xì)胞抗體;②平滑肌抗體;③抗核抗體。必須用小鼠胃組織。
(3)甲狀腺組織:①檢出甲狀腺球蛋白抗體;②檢出甲狀腺微粒體抗體;③檢出抗第二膠質(zhì)抗體;④檢出抗核抗體?捎萌、猴、兔等甲狀腺組織。
(4)腎:①檢出線payment-defi.com/zhuyuan/粒體抗體(遠端腎小管);②抗核抗體;③抗基底膜抗體。
(5)心肌:抗心肌抗體。
(6)橫紋。孩偌o力全并胸腺瘤A帶(暗帶)抗體;②肌無力I帶(明帶)抗體和H帶抗體;③肌無力白纖維骨骼肌抗體;④肌無力骨骼肌紅纖維抗體。
(7)人結(jié)腸;抗結(jié)腸粘膜抗體。
(8)胰腺:胰腺細(xì)胞抗體。
(9)腎上腺:腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞抗體。
(10)神經(jīng)組織:根據(jù)需要將多種抗原組合。
按間接法進行檢測,如發(fā)現(xiàn)某種自身抗體,再作滴度測定,這是一種聯(lián)合篩選試驗,十分簡便,已作常規(guī)應(yīng)用。
7.微波增敏快速自身抗體檢測方法近年微波技術(shù)用于免疫組織化學(xué)檢測自身抗體方法,取得了良好的效果。微波是一種高頻電磁波,經(jīng)微波輻射引起離子極化,旋轉(zhuǎn),分子間磨擦,使能量發(fā)生轉(zhuǎn)換,產(chǎn)生熱能而加快了抗原抗體反應(yīng)的速度,適用于臨床快速檢驗和診斷。
(1)抗原切片(同免疫熒光法)。
(2)微波增敏快速方法
①抗原切片先用PBS洗,吹干,放入濕盒中(用有機玻璃制作,內(nèi)放少許蒸餾水)。
②滴加1:5稀釋的待檢血清,將濕盒移入微波爐內(nèi)轉(zhuǎn)盤上,調(diào)中檔微波強度輻射1min,放置5min。
③PBS洗2次,各1min。
④熒光抗體反應(yīng)1min(同步驟2),放5min 。
⑤PBS洗2次,各1min。
⑥緩沖甘油封片。熒光顯微鏡檢測。
(3)結(jié)果:陽性為黃綠色熒光,陽性為紅色。微波爐型號不同,應(yīng)經(jīng)預(yù)實驗選定強度和時間。