免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)為在細(xì)胞水平上研究免疫反應(yīng)做出了貢獻(xiàn)，但由于光學(xué)分辨率的限制，不可能從細(xì)胞超威結(jié)構(gòu)水平觀察和研究免疫反應(yīng)。因此，Singer于1959年首先提出用電子密度較高的物質(zhì)鐵蛋白（ferritin)標(biāo)記抗體的方法，為在細(xì)胞超威結(jié)構(gòu)水平研究抗原抗體反應(yīng)提供了可能。在此基礎(chǔ)上，相繼發(fā)展了雜交抗體技術(shù)、鐵蛋白抗鐵蛋白復(fù)合物技術(shù)、蛋白A-鐵蛋白標(biāo)記技術(shù)、免疫酶技術(shù)及膠體金技術(shù)等。電子顯微鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（以下簡稱免疫電鏡技術(shù)技術(shù))區(qū)別于免疫細(xì)胞化學(xué)和常規(guī)電鏡技術(shù)主要在以下幾方面：
在這方面的要求是即要保存良好的細(xì)胞超威結(jié)構(gòu)，又要注意保持組織的抗原性。因此，選用固定劑不宜過強(qiáng)。常用的免疫電鏡固定劑有多聚甲醛—戊二醛混合液和過碘酸-賴氨酸—多聚甲醛液（Periodate—Lysine –Paraformaldehyde簡稱PLP液)。也有采用Bouin氏液、Zamboni氏液或4%多聚甲醛液（其配制法見附錄)。國外不少文獻(xiàn)推薦應(yīng)用PLP液于免疫電鏡技術(shù)，認(rèn)為該固定液對含糖類豐富的組織固定效果特佳，因為組織抗原絕大多數(shù)由蛋白質(zhì)和糖兩部分組成，抗原決定簇位于蛋白部分，有選擇性地使糖類固定，就可使抗原性穩(wěn)定。PLP液中過碘酸能氧化糖類，使其產(chǎn)生醛基，再經(jīng)賴氨酸作用，使新形成的醛基分子間和分子內(nèi)相互連接，穩(wěn)定組織抗原。但賴氨酸價格較貴，不如多聚甲醛戊二醛固定液經(jīng)濟(jì)、簡便、效果佳。在取材方面，免疫電鏡技術(shù)較光鏡免疫化學(xué)技術(shù)要求更迅速、精細(xì)。
分為包埋前染色、包埋后染色和超薄切片免疫染色三種。
1．包埋前染色 即先行免疫染色，在解剖顯微鏡下將免疫反應(yīng)陽性部位取出，修整成小塊，按常規(guī)電鏡方法處理，經(jīng)鋨酸固定、脫水、包埋。如果特異性免疫反應(yīng)的范圍太小，為了準(zhǔn)確定位，可作第二次包埋，即第一次包埋時將組織置于兩層thermanox塑料片之間，中夾環(huán)氧樹脂如夾心面包式，進(jìn)行高溫聚合，然后在解剖顯微鏡下取出需要部位作第二次包埋。包埋前染色的組織，以中層較為理想。表層因受機(jī)械修整，結(jié)構(gòu)往往保存不好，深層因抗體不能透入，免疫反應(yīng)弱或無。在作超薄切片前應(yīng)先切半薄切片，尋出免疫反應(yīng)陽性部位。根據(jù)作者經(jīng)驗，半薄切片可在相差顯微鏡下不染色進(jìn)行觀察（指PAP染色法)，免疫反應(yīng)部位呈黑點狀。在HE或甲苯胺藍(lán)染色的半薄切片上，免疫反應(yīng)部位呈棕黃色。據(jù)此定位作超薄切片，可大大提高陽性反應(yīng)檢出率。為避免電鏡鉛、鈾染色反應(yīng)與免疫反應(yīng)之間的混淆，可取相連續(xù)的起薄切片，分別以兩個銅網(wǎng)撈取，其中之一進(jìn)行染色觀察，另一以鈾單染色或不染色進(jìn)行對照觀察。
包埋前染色法的優(yōu)點是：①切片染色前不經(jīng)過鋨酸后固定、脫水及樹脂包埋等過程，抗原未被破壞，易于獲得良好的免疫反應(yīng)。②可在免疫反應(yīng)陽性部位定位作超薄切片，提高電鏡下的檢出率。特別適用于含抗原量較少的組織，但由于經(jīng)過一系列的免疫染色步驟，常出現(xiàn)一定的超微結(jié)構(gòu)損傷。
2．包埋后染色 組織標(biāo)本經(jīng)過固定、脫水及樹脂包埋、制成超薄切片后，再進(jìn)行免疫組化染色。由于是以貼在網(wǎng)上的超薄切片進(jìn)行免疫染色，故又名之載網(wǎng)染色（on grid staining)。必須指出的是：①后固定中是否應(yīng)用四氧化鋨存在不同意見，作者經(jīng)驗一般以不用四氧化鋨為佳，或盡量縮短在四氧化鋨中停留的時間。有作者認(rèn)為，從理論上講，四氧化鋨具有保存抗原的作用，但實踐證明應(yīng)用四氧化鋨可使抗原活性明顯減低。②在載網(wǎng)染色過程中，銅網(wǎng)易與化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)，故需選用鎳網(wǎng)或金網(wǎng)。③在免疫組化處理的全過程中，應(yīng)注意保持網(wǎng)面的濕潤，網(wǎng)面干燥會影響抗體活性。本法的優(yōu)點是超微結(jié)構(gòu)保存較好，方法簡便，陽性結(jié)構(gòu)有高度的可重復(fù)性，還能在同一張切片上進(jìn)行多重免疫染色。但抗原活性在電鏡生物樣品處理過程中可能減弱甚至喪失；環(huán)氧樹脂中的環(huán)氧基，在聚合過程中可能與組織成份發(fā)生反應(yīng)而改變抗原性質(zhì)；包埋在環(huán)氧樹脂中的環(huán)氧基，在聚合過程中可能與組織成份發(fā)生反應(yīng)而改變抗原性質(zhì)；包埋在環(huán)氧樹脂中的組織不易進(jìn)行免疫反應(yīng)等。因此，免疫組化工作者曾試圖以不同的方法如飽和苯溶液，無水酒精中NaOH飽和溶液或乙氧化鈉溶液等以減少或去除包埋劑，取得不同程度的效果�，F(xiàn)普遍采用的是在進(jìn)行免疫染色前，以H2O2液蝕刻數(shù)分鐘，以去鋨和增強(qiáng)樹脂的穿透性。
3．超薄冰凍切片按照Tokuyasu建立的方法，將組織置于2.3mol/L蔗糖液中，以液氮速凍，在冰凍超薄切片機(jī)上切片，切片厚度可略厚于常規(guī)樹脂切片。冰凍超薄切片由于不需經(jīng)固定、脫水、包埋等步驟，直接進(jìn)行免疫染色，所以抗原性保存較好，兼有包埋前和包埋后染色的優(yōu)點。
（一)樹脂包埋
國內(nèi)現(xiàn)普遍采用的是環(huán)氧樹脂包埋法，可直接脫水后包埋，也可將小片組織或半薄切片貼在載片上，將充滿環(huán)氧樹脂的明膠囊倒置于切片上聚合、硬化，進(jìn)行原位包埋。
（二)低溫包埋
常規(guī)樹脂包埋由于需高溫聚合等處理程序，組織抗原性可能全部或部分丟失。因此，在免疫電鏡技術(shù)方面，國外不少實驗室已開始采用低溫技術(shù)如低溫包埋和冰凍超薄切片等，后者需配備冰凍超薄切片機(jī)，且技術(shù)難度較大，不如低溫包埋法易推廣。低溫包埋劑的研究開始于60年代，80年代免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)在電鏡水平上的廣泛的應(yīng)用，為低溫包埋劑的實驗研究開辟了廣闊的領(lǐng)域。國內(nèi)已有較多的應(yīng)用報道，國內(nèi)一些實驗室已開始摸索。作為低溫包埋劑的多為乙烯系化合物如乙二醇甲基丙烯酸酯（Glycolmethacrylate,GMA),Lowicryls, LR White和Lr Gold等，目前國外生產(chǎn)廠家有Polysciences INC , Reichert—Jung 和LKB等系列產(chǎn)品�，F(xiàn)將常用的幾種低溫包埋劑及其應(yīng)用簡單介紹如下：
1．Lowicryls 是丙烯酸鹽（acrylate) 和甲基丙烯酸鹽（methacrylate)化學(xué)物質(zhì)，包括K4M、HM20、K11M、KM23等系列產(chǎn)品（Polysciences INC)，其特點是能在低溫下保持低粘度（K4M：--35℃；HM20：-70℃；K11M、HM23：-60℃～-80℃)和具有在光照射（紫外光，波長360nm)下聚合的能力，它的光聚合作用與溫度無度。其中K4M和K11M具有親水性，特別適合于免疫細(xì)胞化學(xué)的應(yīng)用，因它能較好地保持組織結(jié)構(gòu)和抗原性，減少背景染色。HM20和HM23具疏水性，能產(chǎn)生高反差圖像，適用于掃描、透射電鏡和暗視野觀察切片的制作。所有這些種類的低溫包埋劑都適用于冰凍置換技術(shù)。K4M的應(yīng)用和報道較多，現(xiàn)側(cè)重介紹如下：
（1)包埋劑的配制：商品提供的Lowicrys包埋劑由三個部分組成：單體（Monomer)，交聯(lián)劑（Crosslinker)和引發(fā)劑（Initator)。調(diào)整單體和交聯(lián)劑的比例，增加交聯(lián)劑的量，組織塊的硬度增加。中等硬度的組織塊，其配制比例如下：
K4M：單體 17.30g
交聯(lián)劑2.70g
引發(fā)劑0.10g
K11M：單體19.00g
交聯(lián)劑1.00g
引發(fā)劑0.10g
作者的經(jīng)驗，可用微量注射器加針頭抽取后，注入棕色的玻璃容器避光，用玻棒輕攪3～5min或用一小管通入液氮氣泡以攪拌之。勿過分?jǐn)嚢�，以防氧的氣泡進(jìn)入包埋劑中。
（2)生物樣品處理程序（Lemanski 等1985)
①動物麻醉取材，以多聚甲醛—賴氨酸—過碘酸鈉在9℃固定2h。
②磷酸緩沖液含7%蔗糖，pH7.2,沖洗過夜，0℃
③0.1mol/L 磷酸緩沖液，pH7.2,沖洗，0℃
④脫水：65%乙醇，1h ,0℃
80%乙醇，2h,-35℃
LowicrylK4M：80%乙醇=1：11h -35℃
LowicrylK4M：80%乙醇=2：11h -35℃
100%Lowicryl K4M 1h -35℃
100%Lowicryl K4M 過夜-35℃
⑤包埋：新鮮K4M置于膠囊內(nèi)，將組織移入，在-30℃～-40℃以紫外線燈波長360nm 2× 15W（Ladd Research Industries Burlington VT)相距30～40cm照射24h使之聚合。如為100W燈泡，照射距離應(yīng)大于85cm。聚合后的膠囊移至室溫在紫外線下繼續(xù)照射2～3天，可增加其硬度，便于切片。
（3)免疫染色
①切片（厚50～70nm)貼在金網(wǎng)或覆有碳膜的鎳網(wǎng)上。所有下列步驟在室溫、濕盒內(nèi)進(jìn)行。所有溶液需經(jīng)微孔濾紙（0.25～0.45μm)濾過。
②正常羊血清30min。
③第一抗血清（PBS稀釋)，37℃2h。
④可用燒杯法（或塑料壺噴洗法)，以鑷夾鎳網(wǎng)在第一燒杯中洗蕩30min，然后在第二燒杯中洗蕩1h 。
⑤正常羊血清30min。
⑥第二抗血清（膠金標(biāo)記抗體)以正常羊血清稀釋為1：1，以鎳網(wǎng)置于血清滴上孵育1h。
⑦沖洗如④。
⑧覆于2%OSO4水溶液上，30min。
⑨沖洗如④。
⑩干燥后在電鏡下觀察。
（4)Lowicryl K4M快速包埋染色法（Altman等1984)
①包埋劑的配制：單 體13g
交聯(lián)劑2g
引發(fā)劑75mg
②生物樣品處理：除了聚合這一步驟外，下列所有步驟都在20℃進(jìn)行。
1)組織用3%戊二醛—3%多聚甲醛磷酸緩沖液，pH7.4,在20℃固定1～2h。用磷酸緩沖液清洗后進(jìn)行脫水。
2)脫水：在50%、75%和90%的雙甲基甲酰胺（Dimethylformamde,DMF)內(nèi)系列脫水，每步10min。
3)浸透：Lowicryl K4M:DMF=1:2 10min
LowicrylK4M:DMF=1:1 15min
100%Lowicryl K4M 20min
100%Lowicryl K4M 25min
4)包埋與聚合：組織移入裝滿K4M的膠囊中，以紫外線燈照射聚合（紫外線燈條件同上)，燈和組織距離10cm,4℃照射45min，組織塊在室溫進(jìn)行超薄切片（切片時水槽內(nèi)水面應(yīng)略低以防浸濕組織塊的切面)。
5)以覆有碳膜的鎳網(wǎng)撈取切片。
6)免疫染色。
整個包埋時間僅需4～5h。
Lowicryls應(yīng)保存在payment-defi.com/zhuyuan/暗處，-4℃，該物質(zhì)有刺激性，在配制時應(yīng)戴手套，以免觸及皮膚。在通風(fēng)櫥內(nèi)操作，以免蒸氣刺激眼睛。如觸及皮膚和眼睛，應(yīng)立即以水沖洗局部，氧化重金屬如KmnO4能與包埋劑作用而影響染色效果，以不用為佳。
2．LR White 和Lr gold 是一種混合的丙烯酸單體的透明樹脂，具有極低的粘度（8cps)和較強(qiáng)的嗜水性，因此有較強(qiáng)的穿透性，有利于抗體（或抗原)和免疫化學(xué)物質(zhì)穿過LR樹脂，達(dá)到組織結(jié)合部位。在免疫細(xì)胞化學(xué)的光鏡（半薄切片)和電鏡水平應(yīng)用都具有良好效果。標(biāo)本脫水至70%乙醇即可，能較好地保持抗原性。Lr white和Lr gold在國外提供廠家有 Poly－sciences INC等，Lr gold是一種光引發(fā)低發(fā)低溫聚合的包埋劑，對于免疫細(xì)胞化學(xué)特別適用，能最大限度地保持組織的抗原與抗體活性，其最佳光聚合溫度在-25℃，在聚合后呈現(xiàn)金黃色，因而得名。Lr white可在熱和冷兩種情況下聚合，熱聚合在60℃，24h，冷聚合在-25℃，需加加速劑（accelerator)調(diào)整配制比例。生物樣品處理與免疫染色等同常規(guī)樹脂切片。
3．GMA 是乙二醇甲基丙烯酸酯（Glycol Methacrylate 即2—hydroxyethyl methacrylate, HEMA)的縮寫。遠(yuǎn)在60年代，電鏡工作者就試圖將其作為生物包埋劑應(yīng)用于光鏡和電鏡。GMA作為電鏡包埋劑的優(yōu)點是電子密度大，影像反差好。但存在三個主要缺點：一是包埋聚合后的組織塊很脆，不易修整和切片。二是聚合過程中易造成組織損傷如人為的細(xì)胞器腫脹。三是缺乏穩(wěn)定性，不能承受電子束的轟擊，包埋劑遇熱升華，造成組織塌陷變形。故后來為環(huán)氧樹脂所取代。聚合后的環(huán)氧樹脂有良好的塑料穩(wěn)定性，能承受電子束的轟擊不變形，而且影像反差好，分辨率高，但其半薄切片染色不夠滿意始終是個有待解決的問題。而GMA包埋切片的染色效果明顯優(yōu)于環(huán)氧樹脂。于是電鏡工作者如Leduc和Bernhard（1986)嘗試以增加一定比例的增塑劑如甲基丙烯酸酯和少量水外，并加入適量的payment-defi.com/job/增塑劑如聚乙二醇400（PEG400)以改變其硬度，加入適量的聞聯(lián)劑乙烯二甲基丙烯酸酯（ethylene dimethacrylate)以增強(qiáng)其抗電子束轟擊的穩(wěn)定性。為避免聚合時過快，產(chǎn)生高溫，損傷組織結(jié)構(gòu)，選用低溫型引發(fā)劑—過氧化苯甲酰（Benzoyl Peroxide)，溫度范圍-10℃～-30℃。經(jīng)過不斷的配制改進(jìn)，現(xiàn)GMA已廣泛應(yīng)用于半薄切片（1～3μm)的光鏡觀察，特別是組織化學(xué)方面的研究和電鏡水平的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)�，F(xiàn)將GMA包埋劑的配制、生物樣品處理和電鏡水平的免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法簡介如下：
（1)GMA單體溶液在出廠時都加有氫醌類穩(wěn)定劑，用前須以每25ml單體溶液加一匙活性碳，在振蕩器上振蕩5min，過濾以除去氫酯，以免影響聚合。
（2)包埋劑的配制：
a. 100%GMA66.5ml
N—甲基丙烯酸丁酯 28.5ml
5%乙烯二甲丙烯酸酯 5.0ml
1.5 %過氧體苯甲�！�1.0g
1.0%PEG4001.0ml
b.A液：
GMA單體液 90ml
PEG 400 5～9.4ml
過氧化苯甲酰0.2～0.69g
攪拌溶解后置棕色瓶內(nèi)； 4℃保存。
B液：
PEG 400 20ml
二甲基苯胺1ml
應(yīng)用時A：B按10：1比例充分混合（張承志等1986)。
（3)生物樣品處理：組織固定可用PLP液或1%戊二醛溶液（磷酸緩沖液配制，pH7.4)。經(jīng)系列酒精脫水至新鮮的GMA單體溶液中浸24h。以上步驟可在室溫或4℃進(jìn)行。
（4)包埋聚合：組織移入盛潢包埋液的膠囊內(nèi)，先放在真空泵內(nèi)以去除包埋液中的氣泡，然后在4℃，以紫外線燈（波長360nm)在距膠囊底部10～20cm處進(jìn)行照射12～16h，以手指捏膠囊試其硬度可知聚合是否完成。在聚合完成后，將膠囊丟入熱水中以去除膠囊外殼。
（5)切片貼在鎳網(wǎng)上，按PAg技術(shù)進(jìn)行包埋染色，其區(qū)別于EPON包埋劑者，在于GMA包埋切片染色所需時間較短，在第一抗血清中，GMA室溫只需孵育1h，而EPON包埋切片需16～20h；在第二抗血清，即Pag 復(fù)合物中室溫30min，而EPON包埋切片需1h。鈾、鉛雙染后，電鏡觀察。
低溫包埋劑常用于鐵蛋白或膠體金免疫電鏡技術(shù)的包埋后染色。能檢出應(yīng)用環(huán)氧樹脂包埋難以檢出的多種抗原。
為確定方法的特異性，免疫電鏡技術(shù)也需進(jìn)行對照試驗（同第一章 )。
總之，不論哪一種免疫電鏡技術(shù)都面臨微細(xì)結(jié)構(gòu)的保存和組織中抗原活性的保存這一對矛盾，如戊二醛、鋨酸等固定液有利于微細(xì)結(jié)構(gòu)的保存，但對抗原活性有影響，而H2O2能增加樹脂穿透性，但對微細(xì)結(jié)構(gòu)有損傷，能使反應(yīng)部位產(chǎn)生孔洞。在生物樣品處理過程中，應(yīng)同時注意到這兩個方面。其次，每次免疫染色中的清洗工作應(yīng)注意徹底，否則非特異性產(chǎn)物和其他污染物會影響特異性反應(yīng)產(chǎn)物的顯示和觀察。根據(jù)作者經(jīng)驗，以塑料水壺加錐形噴水頭噴洗，與鎳網(wǎng)面成平行方向，即順網(wǎng)面噴洗，較之目前通用的杯水洗滌法易于達(dá)到清潔目的。沖洗的殘留水滴以濾紙吸干時，應(yīng)注意不要觸及載網(wǎng)本身�？蓪V紙剪成三角形，以尖端接觸水滴，即可達(dá)到吸干水份的目的，整個過程中，必須應(yīng)用雙蒸水，容器應(yīng)專用。
