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您現(xiàn)在的位置: 醫(yī)學(xué)全在線 > 理論教學(xué) > 基礎(chǔ)學(xué)科 > 免疫細(xì)胞與核酸分子雜交 > 正文:免疫細(xì)胞化學(xué)的有關(guān)技術(shù)概述
    

免疫細(xì)胞化學(xué)的有關(guān)技術(shù)簡介

  根據(jù)標(biāo)記物的不同,免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)可分為免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù),免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù),免疫鐵蛋白技術(shù),免疫金-銀細(xì)胞化學(xué)技術(shù),親和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù),免疫電子顯微鏡技術(shù)等。近些年來,核酸分子原位雜交技術(shù)采用生物素、地高辛等非放射性物質(zhì)標(biāo)記探針,和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)密切結(jié)合,發(fā)展為雜交免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。不同的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù),各具有獨特的試劑和方法,但其基本技術(shù)方法是相似的,都包括抗休的制備,組織材料的處理、免疫染色、對照試驗、顯微鏡觀察等步驟。還有雙重和多重標(biāo)記技術(shù)也有重要的用途。

  一、抗體的制備和配制

 。ㄒ)抗體的制備

  這是免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的首要試劑,必需制備具有很高特異性和敏感性的高效價抗體,這將在本書第二章 中詳述。目前國內(nèi)外市場各種特異性抗體日益增多,許多實驗室直接應(yīng)用市售產(chǎn)品,現(xiàn)在我國自制抗體種類少,發(fā)展抗體生產(chǎn)十分必要。尤其要定位一種新的抗原物質(zhì),能夠自制較好。

 。ǘ)抗體的配制

  包括抗體貯存液和抗體使用液的配制方法。新制備或購進的是原液或凍干品,抗血清為全血清,單克隆抗體是培養(yǎng)上清液或腹水。

  1.抗體貯存  獲得新抗體后,應(yīng)先根據(jù)生產(chǎn)廠家提供的抗體效價,將其分裝,可每10μl或100μl/支分裝入安瓿或0.25ml帶蓋塑料管中,密封。放入-20。C~40。C冰箱中保存?zhèn)溆,一般可保?~2年。小量分裝的抗體可1次用完,避免反復(fù)凍融而影響效價的降低。一般用前新鮮配制使用液體,稀釋的抗體不能長時間保存,在4。C可存入1~3天,超過7天效價顯著降低。

  2.抗體使用液的配制  這是任何免疫細(xì)胞化學(xué)方法中最重要的一環(huán),無論是一抗、二抗和各種標(biāo)記抗體,用前都必須按不同免疫染色方法和抗原性強弱與抗原的多少,稀釋使用的各種抗體原液,以便獲得最佳免疫染色結(jié)果。

 。1)抗體最佳稀釋度的測定方法:用已知陽性抗原切片,進行免疫染色,將其陽性強度與背景染色強度以“+”表示,可分為++++、+++、++、+、(-)。++++為最強陽性,+++為強陽性,++為較強陽性,+為弱陽性,(-)為陰性。

 、僦苯訙y定法:用于測定第一抗體的最佳稀釋度,其它條件穩(wěn)定可靠。將一抗稀釋為1:50、1:100、1:2001:400、1:500等5個稀釋度滴加在陽性抗原切片上,同時設(shè)一替代和陰性對照,結(jié)果如表1-1:

表 1-1 選擇最佳稀釋抗血清方法

一抗稀釋度 特異性染色強度 非特異性背景染色度
1:50 ++++ ++
1:100 ++++ ++
1:200 ++++ ++
1:400 +++ +
1:500 ++ (-)
陰性對照 (-) (-)

  從表中結(jié)果可見,第一抗體稀釋到1:400時陽性結(jié)果呈強陽性,背景染色減少,其最佳稀釋度在1:400~500之間。再作1:420、1:440、1:460、1:480、1:500稀釋后染色,找出最佳稀釋度。

 、谄灞P(方陣)測定方法:當(dāng)測定兩種以上抗體的最佳配合稀釋度時,必須采用此法(見表1-2)。

表1-2 兩種以上抗體最佳配合稀釋度選擇表

第二抗體 第 一 抗 體
1:500 1:1000 1:2000 1:4000
1:100 ++++(++) ++++(+) +++(±) +(-)
1:200 ++++(+) +++(-) ++(-) ++(-)
1:400 ++(-) +(-) - -

  括號內(nèi)為背景染色結(jié)果

  從表中可見第一抗體1:1000,第二抗體1:2000接近最佳稀釋度,再將一 抗體作1:600、1:700、1:800、1:900和1:1000稀釋,即可找出最佳稀釋度。醫(yī)學(xué)全在線www.med126.com

 。2)抗體稀釋液的配制:常用0.01mol/l pH7.4PBS或TBS緩沖液作抗體稀釋液?捎靡韵路椒ㄅ渲茖S玫目贵w稀釋液,防止抗體效價下降,減少抗體在組織上的非特異性吸附:取0.05mol/l pH7.4 TBS100ml,加溫到60。C,再加入優(yōu)質(zhì)明膠100mg,攪拌溶解后,冷卻至室溫,加入1g牛血白蛋白,加入NaN3200mg溶解后,過濾,分裝,4。C保存。

  抗體的最佳稀釋度由于各種抗體的效價不同,組織中抗原強弱不一,應(yīng)根據(jù)不同情況作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整,以取得中等陽性稀釋度為佳,因其既適合于抗原性強和含量多的標(biāo)本,也可用于抗原性弱的標(biāo)本。

  二、組織材料的處理

  組織材料的處理是獲得良好免疫組織化學(xué)結(jié)果的前提,必需保證要檢測的細(xì)胞或組織取材新鮮,固定及時,形態(tài)保存完好,抗原物質(zhì)的抗原性不丟失、不擴散和被破壞(下節(jié) 詳述)。

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