衛(wèi)生毒理學(xué)電子教材-第六章 外來化合物致突變作用及其評(píng)價(jià):第四節(jié) 化學(xué)致突變物的檢測(cè)

(一) 基因突變?cè)囼?yàn)

1.鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)

又稱Ames試驗(yàn)，檢測(cè)受試物誘發(fā)鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株(his-)回復(fù)突變成野生型(his+)的能力。試驗(yàn)菌醫(yī)學(xué)全在線株都有組氨酸突變(his-)，不能自行合成組氨酸，在不含組氨酸的最低營養(yǎng)平皿上不能生長，回復(fù)突變成野生型后能自行合成組氨酸，可在最低營養(yǎng)平皿上生長成可見菌落。計(jì)數(shù)最低營養(yǎng)平皿上的回變菌落數(shù)來判定受試物是否有致突變性。標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)菌株有四種：TA₉₇和TA₉₈檢測(cè)移碼突變、TA₁₀₀檢測(cè)鹼基置換突變、TA₁₀₂對(duì)醛、過氧化物及DNA交聯(lián)劑較敏感。這四個(gè)試驗(yàn)菌株除了含有his-突變，還有一些附加突變，以提高敏感性。

試驗(yàn)方法有點(diǎn)試驗(yàn)(預(yù)試驗(yàn))和摻入試驗(yàn)(標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn))兩種。在摻入試驗(yàn)中，受試物最高劑量為5mg/皿或出現(xiàn)毒性及沉降的劑量，至少有五個(gè)劑量點(diǎn)，并有陰性(溶劑)對(duì)照和陽性對(duì)照。將受試物、試驗(yàn)菌株培養(yǎng)物和S₉混合液加到頂層培養(yǎng)基中，混勻后鋪在最低營養(yǎng)平皿上，37℃培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)數(shù)可見菌落數(shù)。判斷陽性結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)是，如每皿回變菌落數(shù)為陰性對(duì)照的每皿回變菌落數(shù)的兩倍以上，并有劑量－反應(yīng)關(guān)系，即認(rèn)為此受試物為鼠傷寒沙門氏菌的致突變物。

S₉混合液是用多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)的大鼠肝勻漿9000Xg上清液(S₉)加上NADP及葡萄糖－6－磷酸等輔助因子，作為代謝活化系統(tǒng)。如不加S₉混合液得到陽性結(jié)果，說明受試物是直接致突變物；加S₉混合液才得到陽性結(jié)果，說明該受試物是間接致突變物。只要在一種試驗(yàn)菌株得到陽性結(jié)果，即認(rèn)為受試物是致突變物；僅當(dāng)四種試驗(yàn)菌株均得到陰性結(jié)果，才認(rèn)為受試物是非致突變物。

2.哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)

哺乳動(dòng)物體外培養(yǎng)細(xì)胞的基因正向突變?cè)囼?yàn)常用的測(cè)試系統(tǒng)有小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞，中國倉鼠肺V₇₉細(xì)胞和卵巢CHO細(xì)胞的三個(gè)基因位點(diǎn)的突變，即次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)、胸苷激酶(TK)及Na⁺／K⁺ATP酶(OUA)位點(diǎn)。HGRPT和Na⁺/K⁺ATP酶位點(diǎn)突變可用于上述三種細(xì)胞，OUA位點(diǎn)突變僅適用于CHO細(xì)胞，HGRPT和TK可分別使6－硫代鳥嘌呤(6－TG)轉(zhuǎn)移上磷酸核糖及使5－溴脫氧尿苷磷酰化，它們的代謝產(chǎn)物可摻入DNA引起細(xì)胞死亡，因此正常細(xì)胞在含有這些鹼基類似物的培養(yǎng)基中不能生長，在致突變物作用下此兩個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變的細(xì)胞對(duì)這些鹼基類似物具有抗藥性，可以增殖成為克隆(細(xì)胞集落)。Na⁺/K⁺ATP酶是細(xì)胞膜上的Na⁺/K泵，鳥本苷可抑制此酶活性引起細(xì)胞死亡，當(dāng)致突變物引起該位點(diǎn)突變后，Na⁺/K⁺ATP酶對(duì)鳥本苷的親和力下降，而酶活性不變，故對(duì)培養(yǎng)基中的鳥本苷產(chǎn)生抗藥性，并可增殖為克隆。

(二) 染色體畸變?cè)囼?yàn)

  1.染色體分析 

觀察染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)和數(shù)目改變稱為染色體分析。在國外常稱為細(xì)胞遺傳學(xué)檢驗(yàn)，但這一名稱有時(shí)廣義地包括微核試驗(yàn)和SCE試驗(yàn)，因?yàn)檫@兩個(gè)試驗(yàn)同樣也是在顯微鏡下觀察細(xì)胞染色體的改變。

   對(duì)于結(jié)構(gòu)畸變，一般只觀察到裂隙、斷裂、斷片、微小體、染色體環(huán)、粉碎、雙或多著絲粒染色體和射體。對(duì)于缺失，除染色單體缺失外，需作核型分析。即染色體攝影拍片后，再排列進(jìn)行細(xì)微觀察或用電子計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖象分析。對(duì)于相互易位，除生殖細(xì)胞非同源性染色體相互易位外，倒位、插入、重復(fù)等均需顯帶染色才能發(fā)現(xiàn)。

對(duì)于數(shù)目畸變，需在染毒后經(jīng)過一次有絲分裂才能發(fā)現(xiàn)。但是經(jīng)過一次有絲分裂后，一些結(jié)構(gòu)畸變可能因遺傳物質(zhì)的丟失而致細(xì)胞死亡，因此不能發(fā)現(xiàn)。所以應(yīng)安排多次收獲時(shí)間，以便分別檢查斷裂劑的作用。收獲時(shí)間的安排還應(yīng)考慮外來化合物可能在細(xì)胞周期的不同時(shí)期產(chǎn)生作用，以及延長細(xì)胞周期的作用。

體細(xì)胞的染色體分析可作體內(nèi)或體外試驗(yàn)，體內(nèi)試驗(yàn)多觀察骨髓細(xì)胞，體外試驗(yàn)常用中國倉鼠肺細(xì)胞(CHL)，以及中國倉鼠卵細(xì)胞(CHO)和V₇₉等細(xì)胞系，但任何細(xì)胞系的染色體皆不穩(wěn)定，不能準(zhǔn)確地觀察非整倍體，故在體外試驗(yàn)中，如考慮進(jìn)行染色體數(shù)目觀察，應(yīng)當(dāng)使用原代或早代細(xì)胞，例如人外周淋巴細(xì)胞。體內(nèi)試驗(yàn)與人體實(shí)際接觸情況相似，但應(yīng)注意受試物或其活性代謝產(chǎn)物有可能不易在骨髓中達(dá)到足夠的濃度。體外試驗(yàn)由于受試物與細(xì)胞直接接觸，故往往比體內(nèi)試驗(yàn)靈敏。

2.微核試驗(yàn)

經(jīng)致突變物作用后，染色體無著絲點(diǎn)斷片或因紡錘體受損傷而丟失的整個(gè)染色體在細(xì)胞分裂的后期仍留在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，成為一個(gè)或幾個(gè)規(guī)則的次核，稱為微核。常用嚙齒類動(dòng)物骨髓嗜多染紅細(xì)胞(PCE)微核試驗(yàn)。PCE是紅細(xì)胞成熟的一個(gè)階段，此時(shí)紅細(xì)胞的主核已排出，微核容易辯認(rèn)，PCE胞質(zhì)含RNA染色與成熟紅細(xì)胞易于區(qū)別，故為骨髓微核試驗(yàn)的首選細(xì)胞群。常用小鼠，至少設(shè)兩個(gè)處理組，最高劑量為LD₅₀/7的80%(LD₅₀/7為在7天內(nèi)使半數(shù)動(dòng)物死亡的劑量)，另一組為LD₅₀/7的40%，灌胃或腹腔注射，同時(shí)設(shè)陰性和陽性對(duì)照組，每組至少8只動(dòng)物，雌雄各半。給毒方案有多種，如連續(xù)四天，每天一次。第五天處死，取骨髓，涂片，固定，染色。每鼠計(jì)數(shù)1,000個(gè)PCE的微核出現(xiàn)率。當(dāng)經(jīng)適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)分析，處理組微核率顯著高于陰性對(duì)照組，并呈現(xiàn)劑量－反應(yīng)關(guān)系時(shí)，可認(rèn)為受試物對(duì)該試驗(yàn)動(dòng)物的骨髓細(xì)胞有致染色體損傷的作用。

(三) DNA損傷試驗(yàn)

1.姐妹染色單體交換(SCE)試驗(yàn)

SCE是染色體同源座位上DNA復(fù)制產(chǎn)物的相互交換，SCE可能與DNA的斷裂和重接有關(guān)，提示DNA損傷。SCE試驗(yàn)可分為體外試驗(yàn)、體內(nèi)試驗(yàn)和體內(nèi)、體外結(jié)合試驗(yàn)。體外SCE試驗(yàn)可采用貼壁生長的細(xì)胞，如CHO、V₇₉、CHL等，也可用懸浮生長的細(xì)胞，如人外周血淋巴細(xì)胞。細(xì)胞在含5-溴脫氧尿苷(BrdU)的培養(yǎng)液中生長兩個(gè)周期。由于Brdu是嘧啶類似物，可于合成期中摻入DNA互補(bǔ)鏈，所以在下一個(gè)中期所見染色體姐妹染色單體之間各有一條互補(bǔ)鏈摻入了Brdu，于是Brdu對(duì)稱姐妹染色單體造成同等的干擾，其染色并無區(qū)別。但到了第二個(gè)周期中期相，每個(gè)染色體中只有一條染色單體保留了原來不帶Brdu的模板鏈，而另一條染色單體則是上一周期帶Brdu的互補(bǔ)鏈成為模板鏈。于是經(jīng)兩個(gè)周期的Brdu摻入互補(bǔ)鏈可使兩姐妹染色單體所含Brdu量不相等，從而出現(xiàn)染色差別。如果Brdu僅在第1周期摻入，第2周期不摻入，則第2中期相似可見姐妹染色單體染色有差別。如果DNA單鏈發(fā)生了斷裂，而且在修復(fù)過程中發(fā)生重排，就在第2周期可見姐妹染色單體同位節(jié)段的相互交換。經(jīng)差別染色后，可觀察到兩條明暗不同的染色單體。若兩條染色單體間發(fā)生等位交換，可根據(jù)每條染色單體內(nèi)出現(xiàn)深淺不同的染色片段進(jìn)行識(shí)別和計(jì)數(shù)。

2.程序外DNA合成試驗(yàn)

    基本方法是測(cè)定S期以外³H-胸苷摻入胞核的量，這一摻入量可反映DNA損傷后修復(fù)合成的量。由于此種合成發(fā)生在DNA正常復(fù)制合成主要時(shí)期以外，故稱為程序外DNA合成(unschedule DNA synthesis UDS)試驗(yàn)或DNA修復(fù)合成試驗(yàn)。一般使用人淋巴細(xì)胞或嚙齒動(dòng)物肝細(xì)胞等不處于正在增殖的細(xì)胞較為方便，否則就需要人為地將細(xì)胞阻斷于G₁期，使增殖同步化。然后在藥物的抑制下使殘存的半保留DNA復(fù)制降低到最低限度，才能避免摻入水平很高的半保留復(fù)制對(duì)摻入水平很低的程序外DNA合成的觀察。

 各種致突變?cè)囼?yàn)都有其特定的觀察終點(diǎn)，但實(shí)驗(yàn)結(jié)束后都面臨一個(gè)共同的問題，即所取得的數(shù)據(jù)表示陽性結(jié)果或表示陰性結(jié)果。

在評(píng)定陽性或陰性之前，應(yīng)首先檢查實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量控制情況。致突變?cè)囼?yàn)的質(zhì)量控制是通過：① 盲法觀察和② 陰性對(duì)照和陽性對(duì)照的設(shè)立。盲法觀察是觀察人員不了解所觀察的標(biāo)本的染毒劑量或組別，可免除觀察人員對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)產(chǎn)生主觀影響。陰性對(duì)照指不加受試物的空白對(duì)照，有時(shí)則是加入為了溶解受試物所用溶劑的溶劑對(duì)照。陽性對(duì)照是加入已知突變物的對(duì)照，對(duì)于體外試驗(yàn)應(yīng)包括需活化的和不需活化的兩種已知致突變物�？瞻讓�(duì)照應(yīng)和溶劑對(duì)照的結(jié)果一致，如有顯著差異則可能表明有實(shí)驗(yàn)誤差，如溶劑對(duì)照結(jié)果顯著高于空白對(duì)照則可能溶劑具有致突變性。陰性對(duì)照和陽性對(duì)照結(jié)果都應(yīng)與文獻(xiàn)報(bào)告或本實(shí)驗(yàn)室的歷史資料一致。如差異較大也說明可能有實(shí)驗(yàn)誤差。發(fā)現(xiàn)這些質(zhì)量控制指標(biāo)存在任何疑問時(shí)，均應(yīng)查清存在的問題，并加以解決后，重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

陽性結(jié)果應(yīng)當(dāng)具有劑量反應(yīng)關(guān)系，即劑量越高，致突變效果越大，并在一組或多組的觀察值與陰性對(duì)照之間有顯著差異。如果低劑量組或低、中兩劑量組與對(duì)照組之間的差異有顯著性，而高劑量組差異無顯著性，則陽性結(jié)果不可信或無意義。此時(shí)應(yīng)檢查影響實(shí)驗(yàn)的因素，在排除影響因素后，應(yīng)考慮是否為劑量反應(yīng)關(guān)系曲線的特殊形式所致，即曲線上升至一定程度后下降。如懷疑及此，應(yīng)當(dāng)在零劑量與最高觀察值的劑量之間重新設(shè)計(jì)染毒劑量。

陰性結(jié)果的判定條件是：① 最高劑量應(yīng)包括受試物溶解度許可或灌胃量許可的最大劑量。如該劑量毒性很大，則體內(nèi)試驗(yàn)和細(xì)菌試驗(yàn)應(yīng)為最大耐受量，使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行體外試驗(yàn)，常選LD₅₀或LD₈₀為最大劑量。醫(yī)學(xué).全在線payment-defi.com溶解度大，毒性低的化學(xué)物，在細(xì)菌試驗(yàn)中往往以5mg/皿作為最高劑量。② 各劑量的組間差距不應(yīng)過大，以防漏檢僅在非常狹窄范圍內(nèi)才有突變能力的某些外來化合物。

無論陽性還是陰性結(jié)果都要求有重現(xiàn)性，即重復(fù)試驗(yàn)?zāi)艿玫较嗤�結(jié)果。