衛(wèi)生毒理學(xué)-實(shí)驗(yàn)指導(dǎo):實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染毒途徑和技術(shù)

(一)經(jīng)口(胃腸道)染毒

 常用有喂飼、灌胃和吞咽膠囊等方式。

  1．喂飼  將受試物摻人動(dòng)物飼料或飲水中供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自行攝人。如果受試物是完全無毒的，則在飼料中的最高含量可為5％，一些有營養(yǎng)價(jià)值的食物成分物質(zhì)則可更高，但應(yīng)注意不要造成飼料營養(yǎng)成分失衡而影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生長發(fā)育。喂飼法符合人類接觸受試物的實(shí)際情況，但缺點(diǎn)多，如適口性差的受試物，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物拒食；易揮發(fā)或易水解的受試物不適用。而且，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)單籠喂飼，以食物消耗量計(jì)算其實(shí)際染毒劑量。

2．灌胃  將受試物配制成溶液或混懸液，以注射器經(jīng)導(dǎo)管注入胃內(nèi)。一般灌胃深度從口至劍突下。最好是利用等容量灌胃法，即受試物配制成不同濃度，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單位體重的灌胃容量相同。外源化學(xué)物用溶劑稀釋，一般講濃溶液比稀溶液毒性大，但是也有的外源化學(xué)物稀釋之后毒性反而增加，即存在所謂“稀釋毒性”，其原因尚不清楚。因此在發(fā)現(xiàn)有稀釋毒性時(shí)等濃度灌胃法也可接受。灌胃前應(yīng)禁食空腹，大鼠隔夜禁食，小鼠可禁食4h(因小鼠消化吸收和代謝速度較快)，均不停飲水。灌胃后2—4h提供飼料。經(jīng)口多次染毒，一般不禁食，但應(yīng)每日定時(shí)染毒。灌胃法適用小鼠、大鼠、兔、犬等動(dòng)物，優(yōu)點(diǎn)是劑量準(zhǔn)確，缺點(diǎn)是工作量大，并有傷及食管或誤入氣管的可能。

 (1)小鼠灌胃法；左手拇指和食指捏住小鼠頭部兩耳后皮膚，無名指或小指將尾部緊壓在手上，使小鼠腹部向上。右手持灌胃管(1～2ml注射器上連接以14號(hào)注射針頭，尖端磨鈍，稍加彎曲的灌胃管)，灌胃管長4～5cm，直徑約lmm。操作時(shí)，經(jīng)口角將灌胃管插人口腔，用胃管輕壓小鼠頭部，使口腔和食管成一直線，再將胃管沿上腭壁輕輕插入食管內(nèi)，當(dāng)推進(jìn)約2～3cm左右時(shí)，灌胃管前端約到達(dá)膈肌水平(體重20g左右的小鼠)，此時(shí)可稍感有抵抗。如此時(shí)動(dòng)物無呼吸異常，即可將藥注入。如遇阻力或動(dòng)物憋氣則應(yīng)抽出重插管。如誤插入氣管注藥時(shí)可引起動(dòng)物立即死亡。藥液注完后輕輕退出胃管。操作時(shí)宜輕柔，以防損傷食管及膈肌。

(2)大鼠灌胃法：灌胃法與小鼠相似。采用的灌胃管長約6～8cra，直徑約為1．2mm，尖端磨鈍。插管時(shí)，為防止插人執(zhí)業(yè)醫(yī)師氣管，應(yīng)先抽回注射器針?biāo)�，無空氣抽回說明不在氣管內(nèi)，即可注藥。

(3)犬和家兔灌胃法：由2人操作，將犬關(guān)人特制犬籠，并移動(dòng)活動(dòng)?xùn)�，擠犬并使之固定，持犬者兩手握住犬耳后及頸部皮膚，使犬頭部朝上頸部拉直。灌胃者用一木棍讓犬咬住，將硬質(zhì)胃管自木棍與上腭之間插入食管，約20cm左右即下達(dá)到胃腔(插入深度可預(yù)先在體外測(cè)量好，并做好記號(hào))；持兔者端坐兩腿夾住兔軀干及其后肢，兩手握住兔耳及前肢，將兔頭朝上，使兔頸部拉直。灌胃者用開口器通過兔口角(在犬齒后)之空隙，將開口器向下轉(zhuǎn)動(dòng)數(shù)次，使兔舌伸出。開口器的孔應(yīng)放置在口腔正中央，將硬質(zhì)胃管通過開口器小孔插入食管，約10－15cm左右即下達(dá)到胃腔。如胃管進(jìn)人胃內(nèi)，動(dòng)物較安靜，無掙扎、氣促等表現(xiàn)，應(yīng)先抽回注射器針?biāo)ǎ瑹o空氣抽回說明不在氣管內(nèi)，即可用注射器推入藥液，再推入2～3mi水，以送人留滯在胃管內(nèi)的藥液，灌胃完畢，迅速抽出胃管，然后取出木棍或開口器。

 3．吞咽膠囊  將一定劑量的受試物裝入膠囊中，放至犬的舌后部，迫使動(dòng)物咽下，此法劑量準(zhǔn)確，適用于易揮發(fā)、易水解和有異味的受試物。

  1．靜式吸人染毒  將一定數(shù)量的嚙齒類動(dòng)物放在密閉的染毒柜中，加人易揮發(fā)的液態(tài)受試物或氣態(tài)受試物使成一定濃度。靜式吸入染毒簡易，但缺點(diǎn)較多，主要是隨試驗(yàn)進(jìn)行氧分壓降低(因此，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量有限制)，柜內(nèi)受試物濃度也逐漸下降(由于動(dòng)物吸人消耗、為被毛及染毒柜壁吸附所致)，而且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有經(jīng)皮吸收的可能。染毒時(shí)間一般為2h。要求受試物在lOmin內(nèi)蒸發(fā)完畢。

 柜頂蓋部有三個(gè)附件。一個(gè)是投藥孔，在孔下方用多層紗布或?yàn)V紙作為接受和蒸發(fā)液態(tài)受試物的藥物蒸發(fā)器；一個(gè)是用于混勻蒸氣或氣體的小電扇；一個(gè)是插人溫度計(jì)的孔。在柜的下部的1／4處還留有一個(gè)供采樣的孔。

 靜式吸人染毒時(shí)應(yīng)根據(jù)染毒柜容積和染毒時(shí)間，確定放置的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)，以保證動(dòng)物的最低需氣量(表1—4)。染毒柜所需容積也可按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物總體重(kg)×100×染毒時(shí)間h)來估算，相當(dāng)于動(dòng)物每kg體重每小時(shí)所需空氣體積為100L。

靜式吸入染毒多以計(jì)算方法得到染毒柜內(nèi)受試物濃度，受試物濃度以mg／m．易揮發(fā)液體化學(xué)物計(jì)算公式為

C＝(a·d·l000)／L

式中：C＝設(shè)計(jì)的染毒濃度(mg億)；a＝加入受試物的量(m1)；L：染毒柜容積(L)。

 氣態(tài)化學(xué)物加入為m1數(shù)，可依據(jù)染毒柜容積折算為ppm。單位mg／ml：

記算公式為(式中MW為受試物的分子量)：mg／m³＝(MW·ppm)／22.4

可在染毒期內(nèi)測(cè)定受試物濃度2～3次，以其均值作為實(shí)際染毒濃度。

表1—4  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的最低需氣量及不同染毒柜容積應(yīng)放置的動(dòng)物數(shù)(染毒2h)

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)將動(dòng)物放人染毒柜(亦可連動(dòng)物籠一起放人染毒柜)。

(2)將染毒柜密閉好。

(3)從投藥孔將所需受試物加到藥物蒸發(fā)器上，隨即塞好投藥孔井開始計(jì)算染毒時(shí)

（4)觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的癥狀、死亡時(shí)間，并仔細(xì)記錄。

(5)染毒結(jié)束后，關(guān)閉電源，打開門(蓋)，驅(qū)出柜內(nèi)殘存有毒空氣，取出動(dòng)物，存活者歸籠繼續(xù)觀察。

(6)沖洗染毒柜，將動(dòng)物排泄物沖干凈，擦干染毒柜備用。

2．動(dòng)式吸入染毒  動(dòng)式吸入染毒設(shè)備由染毒柜、機(jī)械通風(fēng)系統(tǒng)和配氣系統(tǒng)三部分構(gòu)成對(duì)設(shè)備的要求較高，優(yōu)點(diǎn)是在染毒過程中染毒柜內(nèi)氧分壓及受試物濃度較穩(wěn)定，缺點(diǎn)是消耗受試物的量大，并易于污染環(huán)境。動(dòng)式吸入染毒又分為整體接觸和口鼻接觸兩種，此設(shè)備設(shè)計(jì)為維持每小時(shí)12~15次的換氣，保證氧氣濃度為19%受試物的均勻分布。染毒柜應(yīng)維持成輕微的負(fù)壓以免受試物從染毒柜逸出。要保證染毒柜中氣流的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的總體積不能超過染毒柜容積的5％。如采用鼻—口或頭部暴露吸入染毒法，可避免經(jīng)口和皮膚同時(shí)接觸受試物。應(yīng)使用適當(dāng)?shù)臐舛瓤刂葡到y(tǒng)。應(yīng)調(diào)整空氣流速，以保證整個(gè)設(shè)備的條件一致。

在染毒柜中受試物濃度達(dá)平衡后，每天的染毒時(shí)間應(yīng)為6h。在必要時(shí)，也可利用其他的暴露時(shí)間。從實(shí)際考慮，每周染毒；天是可接受的。

 進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)溫度應(yīng)維持在(22±2)℃。相對(duì)濕度最好保持40％一60％之間(但不適用于氣溶膠試驗(yàn))．染毒過程中，停止供食和供水。

  在進(jìn)行下述的測(cè)量或監(jiān)測(cè)時(shí)，應(yīng)盡可能地使維持恒定：①氣流速度，每次暴露應(yīng)監(jiān)測(cè)≥3次。②受試物的實(shí)際濃度和氣溶膠濃度粒度分析，每次暴露測(cè)2—4次。③連續(xù)監(jiān)測(cè)溫度，每30min記錄一次。

3.氣管內(nèi)注入；此法用于建立急性中毒模型及塵肺研究。以大鼠為例，用乙醚輕度

麻醉大鼠(側(cè)臥即可)，將麻醉的大鼠用線套住其門齒，掛在染塵架上，鼠背向操作者。用無齒鑷夾住并拉出舌頭，用小塊紗布包裹舌頭，用左手拉住。右手取耳鏡放人大鼠口腔，暴露氣管開口。使光線照射于耳鏡，可見隨呼吸時(shí)張時(shí)閉的v形白環(huán)(聲帶)。術(shù)者左手松開大鼠舌頭并固定耳鏡，右手接過助手傳遞的鈍頭穿刺針，待v形口張開時(shí)把針頭插入氣管約1－1.5cm，此時(shí)針頭已達(dá)氣管的上中段。助手將吸好注射液的注射器接在穿刺針上，回抽如有氣泡，證明位于氣管內(nèi)，即可將受試液注入氣管內(nèi)。術(shù)前所有用具和受試液均應(yīng)消毒，必要時(shí)可在受試液中加青霉素2000IU／ml。

被毛的去除：試驗(yàn)前用機(jī)械法(剪剃毛)或化學(xué)法(硫化胸或硫化鋇)脫毛。對(duì)兔和嚙6類常用的脫毛劑處方為：①硫化鈉8e溶于l00ml水中；①硫化鈉3份、洗衣粉l份、淀粉7份加水調(diào)成糊狀，用脫毛劑前，先剪去脫毛部位的樁毛，注意不可用水浸被毛，以防止脫毛劑順被毛到達(dá)毛根深郎損傷皮膚．用鑷子夾棉球或紗布團(tuán)蘸脫毛荊徐抹在已剪去被毛的部位，3~5min后用溫水洗去脫下的毛和脫毛劑．

 脫毛的要求是不應(yīng)損傷脫毛區(qū)的表皮，脫毛區(qū)面積不大于動(dòng)物體裹面積的l0％。于脫毛后Z4h涂抹一定量受試物，蓋上2～4層紗布和一層玻璃紙或塑料薄膜．再用無刺激性的膠布固定，接觸規(guī)定的時(shí)間。如要求重復(fù)接觸受試化學(xué)物，一般間隔l周再剪剃毛1次。

注射用藥品，應(yīng)以注射途徑染毒，對(duì)非嚙齒類可模擬人擬用注射途徑，而嚙齒類的尾靜脈和肌內(nèi)注射難以多次染毒，必要時(shí)可改為皮下注射或腹腔注射。注射染毒，應(yīng)調(diào)整受試物的pH及滲透壓，pH應(yīng)為5～8，最好是等滲溶液，動(dòng)物對(duì)高滲的耐受力比低滲強(qiáng)。靜脈注射應(yīng)控制速度，大鼠尾靜脈注射最好控制在10秒以上。腹腔注射在遺傳毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中有時(shí)也用，但在致畸試驗(yàn)、肝UDS研究不應(yīng)該用腹腔注射，為避免可能的損傷和局部高濃度對(duì)靶器官的影響。此外，在注射前應(yīng)注意局部消毒；

1．皮下注射(SC)  注射時(shí)以左手拇指和示指提起皮膚，將連有針頭的注射器刺入皮下。皮下注射部位一般犬、貓多在大腿外側(cè)，豚鼠在大腿內(nèi)側(cè)或小腹部；大鼠可在下腹部。兔在背部或耳根部注射。

2．皮內(nèi)注射(ID)  皮內(nèi)注射時(shí)需將注射的局部脫去被毛，消毒后．用左手拇指和食指按住皮膚并使之繃緊，在兩指之間，用結(jié)核菌素注射器連細(xì)針頭，緊貼皮膚表層刺入皮內(nèi)，然后再向上挑起并再稍刺入，即可注射藥液，此時(shí)可見皮膚表面蚊起一白色小皮丘。

3．肌內(nèi)注射(IM)  肌內(nèi)注射應(yīng)選肌肉發(fā)達(dá)，無大血管通過的部位，一般多選臀部。注射時(shí)垂直迅速刺入肌肉，回抽針?biāo)ㄈ鐭o回血，即可進(jìn)行注射。給小鼠、大鼠等小動(dòng)物作肌內(nèi)注射時(shí)，用左手抓住鼠兩耳和頭部皮膚，右手取連有針頭的注射器，將針頭刺人大腿外側(cè)肌肉，將藥液注入。

4．腹腔注射(IP)  大、小鼠腹腔注射時(shí)，以左手抓住動(dòng)物，使腹部向上，右手將注射針頭于左(或右)下腹部刺人皮下，使針頭向前推約o．5cm，再以45度角穿過腹肌，固定針頭，緩緩注入藥液，為避免傷及內(nèi)臟，可使動(dòng)物處于頭低位，使內(nèi)臟移向上腹。著實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為家兔，進(jìn)針部位為下腹部的腹自線旁開lcm處。

5．靜脈注射(IV)

(1)小鼠和大鼠廣般采用尾靜脈注射，鼠尾靜脈有3根，左右兩側(cè)及背側(cè)各一根，左右兩側(cè)尾靜脈比較容易固定，多采用。操作時(shí)先將動(dòng)物固定在鼠筒內(nèi)，使尾巴霹出，尾部用45℃～50℃的溫水浸潤半分鐘或用酒精擦拭使血管擴(kuò)張，并可使表皮角質(zhì)軟化，以左手拇指和食指捏住鼠尾兩側(cè)，使靜脈充盈，用中指從下面托起尾巴，以無名指和小指夾住尾巴的末梢，右手持注射器連號(hào)細(xì)針頭，使針頭與靜脈平行(小于30度)，從距尾尖2~3cm處進(jìn)針，此處皮薄易于刺入，先抽回血，再緩注少量藥液，如無阻力，表示針頭已進(jìn)入靜脈，可繼續(xù)注入。注射完畢后棉球壓迫止血或把尾部向注射側(cè)彎曲以止血．如需反復(fù)注射，應(yīng)盡可能從末端開始，以后向尾根部方向移動(dòng)注射。在毒物動(dòng)力學(xué)研究中大鼠在麻醉后還可采用舌下靜脈注射。

(2)兔，兔耳部血管分布清晰，兔耳中央為動(dòng)脈，耳外緣為靜脈。內(nèi)緣靜脈深不易固定，故不用。外靜脈表淺易固定，常用。先拔去注射部位的被毛，用手指彈動(dòng)或輕揉兔耳，使靜脈充盈，左手示指和中指夾住靜payment-defi.com脈的近端，拇指繃緊靜脈的遠(yuǎn)端、無名指及小指墊在下面，右手持注射6S連6號(hào)針頭盡量從靜脈的遠(yuǎn)端刺人，移動(dòng)拇指于針頭上以固定針頭，放開示指和中指，將藥液注入，然后拔出針頭，用手壓迫針眼片刻。

(3)犬；靜脈注射用前肢內(nèi)側(cè)面皮下的頭靜脈、后肢脛部下1／3的外側(cè)皮下的小隱靜脈，可多次重復(fù)注射或靜脈滴注。

對(duì)于各種染毒途徑的最大容積，以受試的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物物種或制劑來確定．一般推薦，染毒最大容積為：①經(jīng)口20mi／kg(對(duì)空腹動(dòng)物)：②經(jīng)皮2mi／kg(根據(jù)體表面積計(jì)算，限于染毒的準(zhǔn)確性)；③靜脈lml／kg(5min以上)；④肌內(nèi)注射o.5mi／kg(一個(gè)部位)；⑤每眼0.01ml;⑥直腸0.5ML／kg⑦陰道：大鼠0.2ml，兔lml；⑧吸人2mg／L；⑨鼻：猴或犬每鼻孔0.1m1�！�