實驗二十五 核酸探針和分子雜交技術(shù)
一、分子雜交技術(shù)的基本原理
分子雜交技術(shù)是根據(jù)兩條單鏈DNA中互補堿基序列能專一配對的原理進行的。若兩個退火的單鏈來源不同(如一個同位素標記的探針DNA加入源于臨床標本的DNA中)，這一反應(yīng)通常稱為雜交。所謂探針是指用某種方法標記的DNA或RNA片段，它能用于測定標本中是否存在與之互補的DNA或RNA序列。目前實驗室常用的核酸雜交方法包括：Southern印跡法、Northern印跡法、斑點雜交法、原位雜交法等。
1．Southern印跡法(Southernblot) 將待測DNA用限制性內(nèi)切酶切割后，其片段在瓊脂糖凝膠電泳中按分子量大小分離，隨后使DNA在原位發(fā)生變性，并從凝膠轉(zhuǎn)移到一固相支持物(硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上，再用標記的探針與固著于濾膜上的DNA雜交，最后根據(jù)探針的標記方法不同而采用不同的檢測方法，確定與探針互補的電泳條帶的位置。由于DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶在特定位點進行切割，故不僅可檢出雜交片段的數(shù)量和大小，而且可在一定程度上反映待測DNA的基因組成。
2．Northern印跡法(Northernblot) 與Southern印跡法相似，只不過待測核酸為RNA，由于RNA只有被有效轉(zhuǎn)錄才能在Nort中國衛(wèi)生人才網(wǎng)hern雜交中顯示出來，所以此法可作為研究特定基因表達的手段。
3．斑點雜交法(dotblot) 將待測的DNA標本直接點在硝酸纖維素濾膜上，經(jīng)變性處理后用探針進行雜交。這種方法省去內(nèi)切酶消化、電泳、轉(zhuǎn)移等步驟，是一種快速、方便的優(yōu)點。
4．原位雜交法(insitu hybridization) 為核酸雜交技術(shù)與細胞學技術(shù)相結(jié)合的一種特殊檢測方法。它在不破壞細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的情況下，用標記的探針直接檢測切片標本中的核酸。此法不需從細胞中提取核酸，可直接了解細胞內(nèi)基因的定位及分布情況，最適宜外科活檢標本、病理切片標本等，不但能確定有無微生物序列的存在，還可清楚地了解到哪些細胞受到影響。
二、核酸探針的類型及標記方法
1．探針的類型 任何形式的核酸(DNA、RNA)經(jīng)適當標記后均可作為探針用于雜交，根據(jù)核酸的性質(zhì)可將探針分為以下幾類：
(1) 全染色體探針 這類探針制備簡便，主要用于細菌的檢測，但特異性不如克隆片段探針。
(2) 克隆片段DNA 這是目前使用最多的探針類型，由于克隆片段的特異性可以選擇，因而它具有更大的靈活性，而且便于進一步分析DNA結(jié)構(gòu)及發(fā)展新的檢測技術(shù)，如PCR技術(shù)。
(3) RNA及其cDNA探針 RNA探針具有與DNA雜交親和力強、不會發(fā)生自身雜交、
未雜交探針易于去除等優(yōu)點，但探針制備較為費時，產(chǎn)量較低，且易被RNase降解。其cDNA探針則穩(wěn)定性較好，可用多種方法標記，并且產(chǎn)量較高。
(4) rDNA(rRNA基因)探針 rDNA，即rRNA基因。rRNA是核蛋白體的主要成分，胞內(nèi)含量豐富。不同菌種其rDNA的核甘酸序列不同，且在進化上十分保守，故可用特異的rDNA探針檢測相應(yīng)rRNA靶序列來確定細菌的種類。
(5) 寡核苷酸探針 為人工合成的短鏈核苷酸，特異性高，可檢出點突變。因其短小、易穿入組織，可用于原位雜交，但同時也由于核苷酸序列短，樣品中與之相似的序列較多，造成雜交背景提高或出現(xiàn)假陽性。
2．探針的標記方法 分放射性標記與非放射性記兩大類。放射性同位素標記的探針敏感性高，分辨力強，但成本高，操作煩瑣、費時，對操作人員危險性大，廢棄物難以處理，而且很多同位素半衰期很短，也限制了其標記的探針的壽命。非放射性標記是在核酸鏈上共價連接半抗原、生物素或熒光素等化學基團，雜交后通過酶底物顯色或熒光計檢測。非放射性標記探針具有使用周期長，檢測程序簡單，節(jié)省費用，對操作人員健康無威脅等優(yōu)點，有些探針的靈敏度已達到或接近放射性同位素標記的探針。目前生物素或地高辛標記的探針越來越受到普遍的歡迎。
三、操作過程
血清標本點樣
1．0.45μm孔徑硝酸纖維素膜(國產(chǎn)可用混合纖維素酯微孔濾膜)。
2．加樣器、抽濾板。
3．試劑 溶液I：1mol/LNaOH；溶液Ⅱ：0.6mol/LTris·HCl(pH7.4)；溶液Ⅲ：pH7.4，3.0mo1/LNaCl；0.5mol/L Tris·HCl；溶液Ⅳ：2xSSC(0.3mol/LNaCl，0.3mol/L枸櫞酸鈉)。
【方法】
1．取上述濾膜用溶液Ⅳ浸透，置抽濾板上，按水泵減壓法緩慢抽濾。
2．將膜置液I上變性，30min后，用溶液Ⅱ、Ⅲ分別中和，80℃干烤2h以固定核酸(此時為單鏈)。
探針制備
【材料】
1．缺口翻譯(NickTranslation)試劑：緩沖液、dNTP混合物(如同位素標記者為32P-dATP，則加入dCTP，dGTP及dTTP)、同位素標記dNTP(加dATP)、DNA酶I、DNA多聚酶I。
2．SephadexG50柱、閃爍計數(shù)器、待標記病毒DNA。
【方法】
1．取lμg待標記病毒DNA，加入同位素標記的dNTP，補充未標記的其他dNTP，加入DNA酶I(打開DNA鏈上缺口)及DNA多聚酶I(同時將各dNTP進行聚合，以一條鏈為模板，聚合另一條相應(yīng)互補鏈)，從而使病毒DNA標上同位素。14℃水浴2h使反應(yīng)完成。
2．加入終止反應(yīng)液后，上SephadesG50(葡聚糖柱)，以分離聚合的DNA鏈與游離的小分子dNTP。第一峰為標記探針，后峰為游離dNTP。
3．用閃爍計數(shù)器計算標記的cpm數(shù)。
預雜交及雜交
【材料】
1．厚塑料紙，封口機。
2．預雜交液：甲酰胺SSC,Deinhardt液、低分子量DNA、緩沖液。
3．雜交液：預雜交液、硫酸葡聚糖及煮沸后迅速冷卻的探針DNA(使成單鏈)。
【方法】
1．在三面封口的塑料袋中加入已制備好的有樣品的濾膜。加入預雜交液，趕去氣泡。封口后，42℃水浴振搖以預雜交6～4h。
2．棄去預雜交液，加入雜交液，封口后，42℃振搖雜交24～6h。
3．倒去雜交液，用高鹽、低鹽洗液洗滌濾膜。
4．包X光片，置-70℃曝光。經(jīng)一時間后，取出X光片定影、顯影。
