藥物分析-授課教案:第四章藥物定量分析與分析方法驗(yàn)證

基本內(nèi)容

注解（進(jìn)展、輔助

手段和時(shí)間分配)

第一節(jié) 定量分析樣品的前處理 

一、概述

1　藥物結(jié)構(gòu)與分析前處理的關(guān)系 　

1.1　有機(jī)鹵素藥物

 鹵素直接與藥物分子的碳相連者，不包括某些有機(jī)藥物的鹵酸鹽。

 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：C—X

鹵素與脂鏈相連：三氯叔丁醇

與芳雜環(huán)相連：泛影酸

1.2　含金屬有機(jī)藥物

硬脂酸鎂

1.3　有機(jī)金屬藥物

汞撒利

復(fù)習(xí)舊課（3min)

引入新課（2min)

5min

結(jié)合PPT講解。

加以比較，提高效果。

基本內(nèi)容

注解（進(jìn)展、輔助

手段和時(shí)間分配)

2　不經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法

2.1　直接測(cè)定法

直接滴定法

　 如：葡萄糖酸鈣的含量測(cè)定

氧化還原滴定法

　 如：富馬酸亞鐵的含量測(cè)定

　　　 葡萄糖酸銻鈉的含量測(cè)定

2.2　經(jīng)水解后測(cè)定

堿水解后測(cè)定法

CCl3-C(CH3)2-OH + 4NaOH 　加熱回流

(CH3)2-CO + 3NaCl + HCOONa + 2H2O

   NaCl+AgNO3→AgCl↓+NaNO3

   AgNO3+NH4SCN →AgSCN ↓+NH4NO3

酸水解后測(cè)定法

2.3　經(jīng)還原分解后測(cè)定法

3　經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法

3.1　濕法破壞

HNO3-HClO4法

HNO3-H2SO4法

H2SO4-K2SO4法

其它濕法： HNO3-H2SO4-HClO4法；H2SO4-H2O2法；H2SO4-KMnO4法。

40min

通過PPT講解具體實(shí)例。

50min

基本內(nèi)容

注解（進(jìn)展、輔助

手段和時(shí)間分配)

（一)常量凱氏定氮法

1. 原理

  樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出。

①　用H3BO3吸收后再以硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可以計(jì)算出氮的含量。

②　也可以用過量的標(biāo)準(zhǔn)H2SO4或標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定過量的酸。

整個(gè)過程分三步：消化、蒸餾、吸收與滴定

① 消化 總反應(yīng)式：

v  

  脫水作用—使有機(jī)物脫水并碳化為C、H、N。

  氧化作用—將有機(jī)物炭化后的碳氧化為二氧化碳，硫酸則被還原成二氧化硫。

  2H2SO4 ＋C ＝2SO2＋ 2H2O ＋CO2

  二氧化硫使氮還原為氨，本身則被氧化為三氧化硫，氨隨之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中。

此處為新增內(nèi)容，結(jié)合PPT講解。

整個(gè)過程分幾步？

基本內(nèi)容

注解（進(jìn)展、輔助

手段和時(shí)間分配)

（2)加入硫酸鉀的作用是：提高溶液沸點(diǎn)而加快有機(jī)物的分解（3400C→ 4000C)

K2SO4+H2SO4=2KHSO4 

   2KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3

   　但硫酸鉀加入量不能太大，否則消化體系溫度過高，又會(huì)引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解而造成損失：

  （NH4)2SO4=NH3↑+(NH4)HSO4

2(NH4)HSO4=2NH3↑+2SO3↑+2H2O

  　 除硫酸鉀外也可加入硫酸鈉，氯化鉀等鹽類來提高沸點(diǎn)，但效果不如硫酸鉀。

(3)加入硫酸銅的作用

  催化作用：加速有機(jī)物的氧化分解

   C＋2CuSO4 →  Cu2SO4 ＋ SO2↑＋  CO2↑ 

   Cu2SO4 ＋ 2H2SO4 → 2CuSO4 ＋ 2H2O ＋ SO2↑

   此反應(yīng)不斷進(jìn)行，待有機(jī)物被消化完后，不再有硫酸亞銅（褐色)生成，溶液呈現(xiàn)清澈的藍(lán)綠色。

消化完全指示：藍(lán)綠色；

蒸餾時(shí)堿性反應(yīng)完全指示：變深藍(lán)色或產(chǎn)生黑色沉淀。

② 蒸餾

　　在消化完全的樣品溶液中加入濃氫氧化鈉使呈堿性，加熱蒸餾，即可釋放出氨氣

　　  (NH4)2SO4 + 2NaOH  →  2NH3  + Na2SO4  + 2H2O

③ 吸收

　　用硼酸溶液，并加入混合指示劑(甲基紅－溴甲酚綠)，硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.8X10-10)，與氨形成強(qiáng)堿弱酸鹽，酒紅色→藍(lán)綠色。

　　2NH3 + 4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O

④ 滴定

　　待吸收完全后，再用硫酸滴定液（0.05mol/L)滴定,

藍(lán)綠色→灰紫色。

   (NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=（NH4)2SO4+4H3BO3

二、 微量凱氏定氮法

適用范圍：此法主要用于測(cè)定含有氨基或酰胺結(jié)構(gòu)的藥物含量。如撲米酮等。

各試劑的作用？

基本內(nèi)容

注解（進(jìn)展、輔助

手段和時(shí)間分配)

儀器、試劑:

500mL凱氏燒瓶、凱氏定氮裝置

  消化用：①濃硫酸 ②硫酸鉀　③硫酸銅

　蒸餾用：④40%氫氧化鈉溶液

　滴定用：

�、轍2SO4（0.05mol/L)標(biāo)準(zhǔn)溶液

　⑦0.1%甲基紅乙醇溶液與0.1%溴甲酚綠乙醇溶液混合指示劑

3.2　干法破壞

3.2.1　鈉熔法：加無水碳酸鈉高溫?zé)胱�，進(jìn)行有機(jī)破壞。本法適用于濕法不易破壞完全的有機(jī)藥物。

3.2.2　氧瓶燃燒法：是一種破壞最完全的方法，適用于有機(jī)鹵素藥物的有機(jī)破壞…。

原理：將有機(jī)藥物放入充滿氧氣的密閉燃燒瓶中進(jìn)行燃燒，并將燃燒所產(chǎn)生的欲測(cè)物質(zhì)吸收于適當(dāng)?shù)奈�收液中，然后根�?jù)欲測(cè)物質(zhì)的性質(zhì)，采用適宜的分析方法進(jìn)行鑒別、檢查或含量測(cè)定。

(1)儀器裝置

氧瓶燃燒法是一種破壞最完全的方法。

樣品如何制備，操作方法如何？

基本內(nèi)容

注解（進(jìn)展、輔助

手段和時(shí)間分配)

(2)吸收液的選擇

待測(cè)元素的種類 所選用的分析方法

(4)操作法

第二節(jié)  定量分析方法特點(diǎn)

一、容量分析法

1.1　容量法的特點(diǎn)

 簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，適于化學(xué)合成原料藥分析。

1.2　容量分析的計(jì)算問題

滴定度(T)

  每ml的滴定液（mol/L)相當(dāng)于被測(cè)定物質(zhì)的量（mg)。

濃度校正因子（F)

滴定度（T)的計(jì)算：

百分含量的計(jì)算：

（1)直接滴定法

50min

結(jié)合具體實(shí)例講解計(jì)算問題，為后續(xù)課程的計(jì)算打下基礎(chǔ)。

基本內(nèi)容

注解（進(jìn)展、輔助

手段和時(shí)間分配)

　　  W：取樣量　　　 V：消耗滴定液體積

　　  T’：實(shí)際的滴定度　T：規(guī)定執(zhí)業(yè)醫(yī)師的滴定度

（2)間接滴定法

1)生成物滴定法：葡萄糖酸銻鈉的含量測(cè)定。

2)剩余量滴定法（回滴定法)：如：例：司可巴比妥鈉的含量測(cè)定。

二、　光譜法

（一)紫外－可見分光光度法

1．特點(diǎn)：波長(zhǎng)200nm～760nm

①靈敏度高，可達(dá)10-4g/ml～10-7g/ml；②準(zhǔn)確度高，相對(duì)誤差2%～5%；③儀器價(jià)廉，操作簡(jiǎn)便，易普及；④應(yīng)用廣泛。

2．朗伯－比耳定律

A=ELC　　　　 　　　　

3．儀器校正和檢定

由于溫度變化對(duì)機(jī)械部分影響，儀器的波長(zhǎng)經(jīng)常會(huì)略有變動(dòng)。應(yīng)定期全面校正及測(cè)定前校正測(cè)定波長(zhǎng)。汞燈較強(qiáng)譜線或氘燈的486.02nm與656.10nm譜線進(jìn)行校正。

  吸收度的準(zhǔn)確度可用重鉻酸鉀的硫酸溶液檢定。

  雜散光的檢查。

4．對(duì)溶劑的要求

5．測(cè)定法

�。�1)對(duì)照品比較法

　（2)吸收系數(shù)法

�。�3)計(jì)算分光光度法

通過例題對(duì)測(cè)定方法加以練習(xí)。

基本內(nèi)容

注解（進(jìn)展、輔助

手段和時(shí)間分配)

（二)熒光分析法

1．特點(diǎn)　某些物質(zhì)受紫外光或可見光照射后能發(fā)射出比激發(fā)光波長(zhǎng)較長(zhǎng)的熒光。

（1)靈敏度高，10－10g/ml～10－12g/ml。

（2)在低濃度溶液中進(jìn)行。

（3)必須做空白試驗(yàn)。

（4)對(duì)易被光分解的樣品，可選擇一種激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)與之近似而對(duì)光穩(wěn)定的物質(zhì)配成適當(dāng)濃度的溶液，作為基準(zhǔn)溶液。用基準(zhǔn)溶液代替對(duì)照品溶液校正儀器的靈敏度。

（5)采用熒光衍生試劑，常使無熒光或弱熒光物質(zhì)得到強(qiáng)熒光性產(chǎn)物，擴(kuò)大了熒光分析法的范圍。

（6)取樣少，方法快速。

三、色譜分析法

（一)高效液相色譜法

1．對(duì)儀器的一般要求

2．系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

（1)色譜柱的理論板數(shù)(n)

（2)分離度

（3)重復(fù)性

（4)拖尾因子

3．測(cè)定法

（1)內(nèi)標(biāo)法加校正因子測(cè)定供試品中主成分含量

（2)外標(biāo)法測(cè)定供試品中主成分含量

　�、贅�(biāo)準(zhǔn)曲線法；

②外標(biāo)一點(diǎn)法。

（二)氣相色譜法

1．對(duì)儀器的一般要求

2．系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

3．測(cè)定法

基本內(nèi)容

注解（進(jìn)展、輔助

手段和時(shí)間分配)

第三節(jié)  藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證

方法驗(yàn)證的目的

   為保證分析結(jié)果的可靠性需對(duì)分析方法進(jìn)行質(zhì)量控制、進(jìn)行認(rèn)證（validation)和評(píng)價(jià)�！胺治龇椒�驗(yàn)證”的目的是證明采用的方法適應(yīng)于相應(yīng)的檢測(cè)要求。

  不同的檢測(cè)要求和不同的分析方法有其相應(yīng)的驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)和方法。  

適用范圍

藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草。

在藥物生產(chǎn)方法變更、制劑的組分變更、原分析方法進(jìn)行修訂時(shí)，所變更的方法。

體內(nèi)分析方法的建立。

驗(yàn)證內(nèi)容

1　準(zhǔn)確度　（Accuracy)

1.1　定義

測(cè)定結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近的程度。

1.2　表示　　

	裝 訂 線

1.3　含量測(cè)定方法的準(zhǔn)確度

1.3.1　原料藥

有已知純度的對(duì)照品或樣品，可直接采用建立的方法測(cè)定樣品計(jì)算回收率。

若無已知純度的對(duì)照品或樣品，必須用所建立的方法測(cè)得結(jié)果與己建立準(zhǔn)確度的另一種方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較。

1.3.2　制劑

用含有已知量被測(cè)物的模擬處方進(jìn)行測(cè)定。

如不能得到制劑的全部組分，可用加樣回收率衡量準(zhǔn)確度。

與標(biāo)準(zhǔn)方法比較。

1.4　數(shù)據(jù)要求

在規(guī)定范圍內(nèi)，至少用9次測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。報(bào)告加入量的回收率（%)或測(cè)定結(jié)果平均值與真實(shí)值之差及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差或可信限。

2　精密度（Precision)

2.1　定義

 　同一均勻樣品，經(jīng)多次取樣測(cè)定所得結(jié)果

之間的接近程度。

2.2　表示方法

30min

不同的檢測(cè)要求和不同的分析方法有其相應(yīng)的驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)和方法。特別是有實(shí)習(xí)過程中，每個(gè)學(xué)生都 要有自己的課題，其中要接觸到相關(guān)內(nèi)容。

基本內(nèi)容

注解（進(jìn)展、輔助

手段和時(shí)間分配)

2.3重復(fù)性、中間精密度及重現(xiàn)性

2.3.1重復(fù)性（repeatability)

    相同的條件，由同一人員用同一儀器測(cè)定所得結(jié)果的精密度。

日內(nèi)精密度 (within day precision)

日間精密度(day to day precision)

中間精密度（intermediate precision)：同－實(shí)驗(yàn)室,不同時(shí)間由不

同人員用不同儀器測(cè)定所得結(jié)果的精密度。

重現(xiàn)性（Reproducibility)：不同實(shí)驗(yàn)室，由不同人員測(cè)定所得結(jié)

果的精密度。 

3　專屬性（Specificity)

選擇性（selectivity)是指在樣品介質(zhì)中有其他組分共存時(shí)該方法對(duì)供試物準(zhǔn)確而專屬的測(cè)定能力。

3.1　鑒別反應(yīng)

　　　結(jié)構(gòu)相似或組分中的有關(guān)化合物，均應(yīng)呈負(fù)反應(yīng)。

3.2　含量測(cè)定和雜質(zhì)測(cè)定

雜質(zhì)對(duì)照品可獲得  　模擬樣品　

雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得

　   同其它方法比較或用加速破壞法

4.檢測(cè)限（Limit of detection, LOD)

4.1　定義

試樣中被測(cè)物能被檢測(cè)出的最低濃度或量。

4.2　方法

非儀器分析目視法

信噪比法

　 S/N=3(2)

5 定量限（Limit of quantitation LOQ)

5.1 定義

樣品中被測(cè)物能被定量的最低量。

非儀器分析方法

儀器分析方法

S/N＝10：1

6　線性（Linearity)

6.1 定義

 　在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，測(cè)試結(jié)果與試樣中被測(cè)物濃度直接呈正比關(guān)系的程度。

　  最小二乘法求回歸方程

　  相關(guān)系數(shù)大于0.999（n≥5)

基本內(nèi)容

注解（進(jìn)展、輔助

手段和時(shí)間分配)

7　范圍（Range)

7.1 定義

　　測(cè)試方法適用的高低限濃度或量的區(qū)間

7.2　原料藥和制劑的含量測(cè)定

　　范圍應(yīng)為測(cè)試濃度的80%～120%。

7.3　制劑含量均勻度檢查

　　范圍應(yīng)為測(cè)試濃度的70%～130%。

8　耐用性（Robustness)

　　在測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度。

效能指標(biāo)的使用要求：

o   非定量分析方法　如鑒別試驗(yàn)除專屬性、耐用性外，其它都不要求。

o   雜質(zhì)的限量檢查除專屬性、檢測(cè)限、耐用性外，其它都不要求。雜質(zhì)的定量測(cè)定除檢測(cè)限外，其它都要求。

o   含量測(cè)定及含量均勻度、溶出度或釋放度的測(cè)定除檢測(cè)限、定量限外，其它都要求。

一、常用樣品的種類、采集和貯藏

(一)血樣

(二)唾液

(三)尿液

二、生物樣品分析前處理技術(shù)

(一)蛋白質(zhì)的去除

(二)綴合物的水解

(三)有機(jī)破壞

(四)分離、純化與濃集

(五)化學(xué)衍生化法

三、定量分析方法的驗(yàn)證

(一)特異性

(二)標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

(三)精密度與準(zhǔn)確度

(四)定量下限

(五)樣品的穩(wěn)定性

(六)提取回收率

(七)質(zhì)控樣品

(八)質(zhì)量控制

(九)測(cè)定結(jié)果

10min

問題討論(5min)；

作業(yè)和習(xí)題布置2(min)；

歸納總結(jié)(3min)。

小 結(jié)

本章主要內(nèi)容為：1.定量分析樣品的前處理；2.定量分析方法的特點(diǎn)；3.藥品分析方法的驗(yàn)證；4. 生物樣品分析方法的基本要求。

復(fù)習(xí)思考題

或

作 業(yè) 題

1.試述氧瓶燃燒法的原理、特點(diǎn)、應(yīng)用范圍、吸收液的作用及選擇原則。

2.干法破壞是如何進(jìn)行的？

3.生物樣品的前處理主要考慮哪幾個(gè)方面的問題？

教 學(xué) 效 果

與 分 析

多媒體教學(xué)和板書相結(jié)合，并結(jié)合一定的實(shí)例，加深學(xué)生對(duì)知識(shí)點(diǎn)的認(rèn)識(shí)和了解。特別是通過問題討論，讓大家對(duì)所學(xué)知識(shí)進(jìn)行回顧、討論，建立一個(gè)互動(dòng)的教學(xué)氛圍。效果較好，為下節(jié)課的繼續(xù)學(xué)習(xí)打下基礎(chǔ)。