生物化學(xué)與分子生物學(xué)-實驗指導(dǎo):實驗十九 二乙酰一肟顯色法測定血清尿素氮含量

實驗十九  二乙酰一肟顯色法測定血清尿素氮含量

【實驗?zāi)康摹?/p>

血清尿素氮的測定方法有多種，熟悉掌握二乙酰一肟法測定血清尿素氮的基本原理；掌握二乙酰一肟法測定血清尿素氮的基本實驗過程。

【實驗原理】

血中尿素（urea)可與雙乙酰反應(yīng)生成二嗪衍生物（diazine derivative)的有色復(fù)合物，顏色深淺正比于尿素含量。與同樣處理之尿素氮標(biāo)準(zhǔn)液比色，可求得血中尿素氮含量。由于雙乙酰本身不穩(wěn)定，故用二乙酰一肟（diacetyl monoxime)來代替。其反應(yīng)式如下：

反應(yīng)中產(chǎn)生的羥胺是干擾物質(zhì)，故須用氧化劑（硫酸、磷酸等)將其氧化除去。此外，提高酸的濃度可提高顯色反應(yīng)的靈敏度，所以反應(yīng)在強酸中進行。

在顯色反應(yīng)中產(chǎn)生的有色復(fù)合物存在著對光不穩(wěn)定的問題。加入硫氨脲（thiosemicarbazide)，既能提高尿素與雙乙酰反應(yīng)的靈敏度，又能增加其顯色的穩(wěn)定性。硫氨脲如果結(jié)合三價鐵離子或鎘離子一起使用更能提高靈敏度。

臨床意義：尿素是體內(nèi)蛋白質(zhì)分解代謝的終產(chǎn)物之一，主要通過腎經(jīng)尿排出體外。當(dāng)腎功能障礙時，尿素排出受阻，血中尿素氮濃度增高。另外，消化道出血，嚴重嘔吐、腹瀉等導(dǎo)致有效血容量減少的疾患，血清尿素氮濃度也會升高。臨床上尿素氮測定常作為腎功能狀況的輔助診斷指標(biāo)之一。

【實驗試劑和器材】

1．試劑

⑴ 酸性試劑：在1000mL容量瓶中加入蒸餾水約100 mL，然后加入濃硫酸44 mL及85%磷酸66 mL，冷卻至室溫后，加入硫氨脲（thiosemicarbazide)50 mg及硫酸鎘（cadmium sulfate，3CdSO₄•8H₂O)2g，溶解后用蒸餾水稀釋至1000 mL刻度。置于棕色瓶中放冰箱內(nèi)可保存半年。

⑵ 2%二乙酰一肟試劑：稱取二乙酰一肟（diacetyl monoxime)20 g，加蒸餾水約900 mL，溶解后再用蒸餾水稀釋至1000 mL。貯于棕色瓶中放冰箱可保存半年。

⑵ 尿素氮貯存標(biāo)準(zhǔn)液（1mL0.2 mg氮)：準(zhǔn)確稱取尿素42.8 mg，加少量蒸餾水溶解后移入100 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度。

⑶ 尿素氮應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)液（1mL0.02 mg氮)：取貯存液10.0 mL，放入100 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度。

2．器材

⑴ 試管及試管架。

⑵ 吸量管。

⑶ 水浴鍋。

⑷ 722型分光光度計。

【實驗步驟】

1．取試管3支，編號，按下表進行操作：

搖勻，置沸水浴中加熱15分鐘，取出,置冷水中冷卻5分鐘；用540nm波長進行比色，以空白管調(diào)零點，讀取測定管和標(biāo)準(zhǔn)管光密度。

2．列公式并進行計算（分別用兩種濃度單位mmol/L和mg%，計算血清尿素氮的含量)。

正常值：正常人血清尿素氮含量為1.79~6.79 mmol/L（5~19 mg%)。

【實驗注意事項】

 1. 該實驗反應(yīng)必須在強酸中進行，而且要加熱。

 2. 實驗涉及到微量定量，因此吸量管取量一定要準(zhǔn)確。

 3. 注意兩種濃度單位mmol/L和mg%的醫(yī)學(xué)招聘網(wǎng)換算。

【思考題】

1. mmol/L與mg%的換算過程中為什么要除以28？

2. 實驗反應(yīng)為什么必須在強酸中進行？強酸在反應(yīng)中起什么作用？