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1 材料與方法
1.1 動(dòng)物與試劑雌性新西蘭大白兔(購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)7只，體質(zhì)量2.5～2.7kg。DMEM培養(yǎng)基、新生牛血清、小牛血清(Gibco公司，美國(guó))、17β_雌二醇、胰蛋白酶、1_{4_[2_(n，n_二甲氨基)乙氧基]苯｝_1，2_二苯_1_丁烯(他莫昔芬)、L_硝基_左旋精氨酸甲酯(左旋_硝基精氨酸甲酯，L_NAME)、亮肽素、抑肽酶、苯甲基磺酰氟、三羥甲基氨基甲烷、考馬思亮蘭(Sigma公司，美國(guó));兔抗iNOS多克隆抗體(Abcam公司，中國(guó))，兔抗caveolin_1多克隆抗體(Fharmingen公司，美國(guó))，NO測(cè)定試劑盒(精美生物工程有限公司，中國(guó))，其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。
1.2 VSMCs培養(yǎng)
利用組織塊貼壁法培養(yǎng)兔胸主動(dòng)脈VSMCs。待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的胰蛋白酶消化傳代。用4～6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)用VSMCs選用SABC免疫組化法α_actin抗體進(jìn)行鑒定。
1.3 MTT比色法檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)量
將VSMC接種于96孔板上，用無(wú)酚紅無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h。在新生牛血清促增殖實(shí)驗(yàn)中，加入體積分?jǐn)?shù)10%的新生牛血清繼續(xù)培養(yǎng)24h。在17β_雌二醇抑制增殖實(shí)驗(yàn)中，加入不同濃度17β_雌二醇提前孵育24h后，再加入10%新生牛血清繼續(xù)培養(yǎng)。每孔加入20μL MTT(5mg/mL)37℃孵育4h后，傾倒培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀于570nm處測(cè)量吸光度。在17β_雌二醇孵育細(xì)胞之前，加入他莫昔芬(10_7mol/L)，或iNOS阻斷劑L_NAME(10_6mol/L)，或caveolin_1蛋白阻斷劑β_MCD(10_3mol/L)提前孵育2h。
1.4 免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)
培養(yǎng)細(xì)胞于6孔培養(yǎng)板中經(jīng)過不同藥物處理后，加入0.1mL蛋白提取液裂解細(xì)胞，收集提取液，離心后取上清液Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，并進(jìn)行SDS_PAGE電泳，電印跡轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，分別與一抗(兔抗iNOS多克隆抗體(稀釋度1∶50)，兔抗caveolin_1多克隆抗體(稀釋度1∶100))和二抗孵育，與ECL試劑反應(yīng)1min后，X光膠片壓片曝光，用IBAS圖像處理系統(tǒng)對(duì)膠片進(jìn)行掃描測(cè)定感光區(qū)帶的感光密度，并進(jìn)行積分處理，以對(duì)照組為100%進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析作圖醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站payment-defi.com。
1.5 VSMCs中NO濃度測(cè)定
采用NO測(cè)定試劑盒，比色法測(cè)定。VSMCs經(jīng)影響因子處理后，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液100μL，加入磷酸鹽緩沖液和硝酸還原酶，37℃孵育1h，加入顯色劑后530nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。NO(μmol/L)=測(cè)定管OD/標(biāo)準(zhǔn)管OD×100μmol/L。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
數(shù)據(jù)以±s表示。用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，以單因素方差分析，組間比用t檢驗(yàn)。
2 結(jié)果
2.1 不同濃度17β_雌二醇對(duì)10%新生牛血清誘導(dǎo)的VSMCs活性增加的影響MTT比色法是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法，實(shí)驗(yàn)中活細(xì)胞數(shù)量多少可反映細(xì)胞增殖情況。從圖1可以看出，10%新生牛血清處理VSMCs 24h后，細(xì)胞活性比正常對(duì)照組的明顯增加(n=6，P<0.05)。提前用10_5～10_10 mol/L的17β_雌二醇預(yù)處理VSMCs 24h，均可抑制10%新生牛血清誘導(dǎo)的VSMCs增殖，其作用以10_8mol/L 17β_雌二醇最明顯(n=6，P<0.05)。
與正常對(duì)照組比 ^P<0.05;與10%新生牛血清組比 #P<0.052.2 不同阻斷劑對(duì)17β_雌二醇抑制VSMCs活性增加的影響提前用17β_雌二醇受體阻斷劑他莫昔芬(10_7mol/L)孵育細(xì)胞2h，結(jié)果顯示，他莫昔芬預(yù)處理可部分逆轉(zhuǎn)17β_雌二醇對(duì)VSMCs增殖的抑制(n=6，P<0.05，圖2)。β_MCD提前孵育2h，與17β_雌二醇孵育組比，10_5mol/L β_MCD可部分阻斷17β_雌二醇抑制VSMCs增殖的作用(n=6，P<0.05)。為探討iNOS在17β_雌二醇抑制VSMCs增殖中的作用，我們選用L_NAME提前孵育細(xì)胞，結(jié)果顯示，L_NAME提前孵育后與17β_雌二醇孵育組比，細(xì)胞活性明顯增高，提示，L_NAME可部分阻斷17β_雌二醇抑制VSMCs增殖的作用(n=6，P<0.05)。他莫昔芬、β_MCD或L_NAME單獨(dú)孵育對(duì)VSMCs增殖無(wú)影響。
圖2 他莫昔芬，β_MCD，L_NAME對(duì)17β_雌二醇抑制VS_MCs活性的影響(n=6。1正常對(duì)照組 210%新生牛血清組 310%新生牛血清+17β_雌二醇組 410%新生牛血清+17β_雌二醇+他莫昔芬組 5他莫昔芬組 610%新生牛血清+17β_雌二醇+β_MCD組 7β_MCD組 810%新生牛血清+17β_雌二醇+L_NAME組 9L_NAME組)
