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癲癇是由多種病因所致的發(fā)作性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，很多機(jī)制至今不明。而對(duì)于人類來說，人腦的特殊性使人類癲癇的研究還存在很大困難。因此，建立能模擬人類癲癇發(fā)作的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型對(duì)于癲癇研究至關(guān)重要。近年來，本研究室發(fā)現(xiàn)槐定堿(SRI)可導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)癇樣放電[1]，因此利用槐定堿建立了一種全身性發(fā)作的癲癇動(dòng)物模型，在本研究中，我們通過觀察槐定堿(最佳劑量為47.83mg/kg)引起大鼠癲癇發(fā)作的行為表現(xiàn)、癲癇發(fā)作的潛伏期、發(fā)作程度、發(fā)作持續(xù)時(shí)間及海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)一步評(píng)價(jià)槐定堿點(diǎn)燃癲癇模型的效應(yīng)，從而探討癲癇的發(fā)病機(jī)制。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑： 日立H-600電鏡(日本日立公司);BMJ-Ⅲ型組織包埋機(jī)(常州市郊區(qū)中威電子儀器廠);PHY-Ⅲ病理組織漂烘儀(常州市郊區(qū)中威電子儀器廠);78HW-1 型恒溫磁力攪拌器(杭州儀表電機(jī)有限公司);槐定堿(寧夏鹽池藥廠，批號(hào)為021180);苯巴比妥鈉(上海新亞藥業(yè)有限公司，批號(hào)為040603);多聚甲醛(北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，分析純，批號(hào)為20020203)。
1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：健康成年Sprague-Dewley(SD)大鼠(雌雄不拘)30只，體重180-220g(由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(寧)2005-001，隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組(NS)、槐定堿致癇組(SRI)，苯巴比妥鈉﹢槐定堿組(PBS+SRI)，每組各10只。
1.3 動(dòng)物模型制備及大鼠驚厥分級(jí)：槐定堿致癇組大鼠腹腔注射槐定堿(47.83mg/kg)，而生理鹽水對(duì)照組大鼠腹腔注射相同容量的生理鹽水，苯巴比妥鈉﹢槐定堿組預(yù)先腹腔注射苯巴比妥鈉20mg/kg,0.5 h后按上述劑量(47.83mg/kg)腹腔注射槐定堿，觀察大鼠行為表現(xiàn)，連續(xù)觀察2h(超過此時(shí)間，癲癇一般不再發(fā)作)。觀察指標(biāo)：①潛伏期：從腹腔注射SRI到大鼠首次出現(xiàn)癇性發(fā)作的時(shí)間為潛伏期;②發(fā)作持續(xù)時(shí)間：大鼠癇性發(fā)作達(dá)Ⅳ級(jí)及以上后所持續(xù)的時(shí)間;③發(fā)作程度。按照Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[2]，將動(dòng)物癇性發(fā)作的表現(xiàn)分為0級(jí)：無任何反應(yīng);Ⅰ級(jí)：面部抽搐及咀嚼;Ⅱ級(jí)：點(diǎn)頭和(或)甩頭;Ⅲ級(jí)：前肢陣攣;Ⅳ級(jí)：前肢陣攣伴伸直;Ⅴ級(jí)：前肢及全身陣攣，失去平衡，跌倒。Ⅲ級(jí)及以下為輕型發(fā)作，Ⅳ級(jí)及以上為重型發(fā)作。Ⅳ級(jí)以下判定為無效，表現(xiàn)為輕型發(fā)作[2]。
1.4 電鏡觀察：以上各組大鼠于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)經(jīng)腹腔注射20% 烏拉坦(0.5g/kg)麻醉后迅速開胸暴露心臟，沿左心室向升主動(dòng)脈插管并固定，右心耳剪一小口，先快速灌入生理鹽水300ml充分沖洗血液，然后換4%多聚甲醛戊二醛混合溶液500ml約1h 進(jìn)行組織固定，見四肢、尾陣攣直至僵直表明灌注良好。斷頭取腦，切取海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)部位3mm×3mm×3mm的腦組織，將其放入0.1mol二甲砷酸鈉緩沖液中沖洗后保存在2%-2.5%的戊二醛固定液中2h。再換為0.1mol二甲砷酸鈉緩沖液漂洗3次，每次間隔2h，過夜保存在4℃冰箱，用于電鏡觀察。
