 |
 |
1.2 研究方法
1.2.1 外周血白細(xì)胞的分離
提取病例組及對(duì)照組肘靜脈新鮮全血15ml，立即用EDTA抗凝。離心棄去血漿后再加淋巴分離液，移液器收集界面上的白細(xì)胞層，離心棄上清可見白色的沉淀，加入Trizol試劑，用移液器充分抽打、混勻，直到形成清亮不粘稠的液體。
1.2.2細(xì)胞總RNA的抽提與鑒定
Trizol法抽提細(xì)胞總RNA，樣品經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)A230、A260、A280值，甲醛變性膠電泳檢測(cè)28S、18S條帶變化，鑒定樣品質(zhì)量是否符合表達(dá)譜芯片的實(shí)驗(yàn)要求。
1.2.3對(duì)樣品RNA進(jìn)行熒光標(biāo)記
雙鏈cDNA的合成與純化，以cDNA為模板用隨機(jī)引物和Klenow酶進(jìn)行DNA鏈的標(biāo)記，并在DNA鏈延伸過程中摻入熒光素。
1.2.4雜交與清洗
將標(biāo)記的DNA溶于雜交液中42℃雜交過夜，清洗后玻片甩干即可用于掃描。
1.2.5信號(hào)掃描和分析
芯片用ScanArray Express雙通道激光掃描儀進(jìn)行掃描，分別得到子癇前期外周血cDNA的Cy5圖像文件和正常妊娠外周血的Cy3圖像文件。采用GenePix Pro 4.0圖像分析軟件分析Cy3和Cy5兩種熒光信號(hào)的強(qiáng)度和比值，對(duì)芯片上的數(shù)據(jù)用Lowess方法進(jìn)行歸一化；最后以差異為兩倍的標(biāo)準(zhǔn)來確定差異表達(dá)基因。比值>2.0表示子癇前期外周血基因表達(dá)水平高于正常妊娠，比值<0.5則顯示子癇前期外周血基因表達(dá)水平低于正常妊娠。
2結(jié)果
2.1總RNA抽提與鑒定結(jié)果醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站payment-defi.com
樣本的總RNA經(jīng)紫外分光A230、A260、A280測(cè)定，甲醛變性膠電泳檢驗(yàn)RNA樣品質(zhì)量符合表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)要求。OD260/OD280值為1.714～1.965，均介于1.7～2.1之間。結(jié)果顯示總RNA無降解，28S、18S條帶清晰，28S比18S的亮度接近2∶1，提示得到高純化的總RNA。
2.2基因表達(dá)譜芯片雜交結(jié)果
圖1和圖2均為Cy5熒光標(biāo)記的子癇前期外周血白細(xì)胞cDNA雜交掃描圖像與Cy3熒光標(biāo)記的正常妊娠外周血白細(xì)胞cDNA雜交掃描圖像的疊加圖像。在圖像中，如果Cy3信號(hào)較強(qiáng)，該點(diǎn)呈綠色，表示該基因呈下調(diào)趨勢(shì)；如果Cy5信號(hào)較強(qiáng)，該點(diǎn)呈紅色，表示該基因呈上調(diào)趨勢(shì)。在兩種外周血中表達(dá)水平相當(dāng)?shù)娘@黃色，而均不表達(dá)的則為無色。圖1顯示腫瘤壞死因子（TNF-α)在子癇前期外周血表達(dá)增高，Cy5信號(hào)較強(qiáng)，呈紅色。圖2顯示白介素-4受體（IL4R)在子癇前期外周血表達(dá)降低，Cy3信號(hào)較強(qiáng)，呈綠色。
