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許多研究認(rèn)為[1-3]椎間盤軟骨終板下骨的微循環(huán)障礙可致椎間盤營(yíng)養(yǎng)供給障礙,是椎間盤退變的重要病因之一。因此建立一種可靠的腰椎椎體缺血性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,不僅可以研究脊柱退變的發(fā)病機(jī)制,而且也可為椎間盤退變的病因治療提供研究平臺(tái)[4-6]。椎間盤退變動(dòng)物模型分為自發(fā)性和誘導(dǎo)性兩種。自發(fā)性椎間盤退變模型是通過(guò)系統(tǒng)方法引起動(dòng)物遺傳性狀或行為方式改變,最后引起椎間盤退變的發(fā)生,誘導(dǎo)性。椎間盤退變模型又分為機(jī)械性損害模型和結(jié)構(gòu)性損害模型[7-10]。目前國(guó)內(nèi)未見(jiàn)利用椎體缺血導(dǎo)致椎間盤退變的動(dòng)物模型建立的報(bào)道。本研究通過(guò)經(jīng)皮穿刺新西蘭大白兔腰椎終板側(cè)椎體注射平陽(yáng)霉素,并以MRI及病理學(xué)觀察腰椎終板及椎間盤的退變。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料
選取36只新西蘭大白兔,雌雄不限,平均月齡2個(gè)月,質(zhì)量(3 200 ± 30) g,清潔級(jí),由中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。每只選取兩個(gè)椎體作為實(shí)驗(yàn)組(第5腰椎,L5)和對(duì)照組(第4腰椎,L4)。單籠飼養(yǎng),室溫控制在25 ℃左右。平陽(yáng)霉素粉針為天津太河制藥有限公司生產(chǎn),8 mg/支;骨穿刺針17 G × 10 cm(德國(guó)Angiomed公司)。
1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理
0.3 g/L戊巴比妥1 mL/kg經(jīng)兔耳緣靜脈注射, 麻醉成功后將兔俯臥于固定板上,腰背部剃毛備皮。在Philips Allura Xper FD20型大平板DSA手術(shù)臺(tái)上消毒鋪單,正位透視下,17 G骨穿針在椎體下1/3。正中線右側(cè)旁開(kāi)約1 cm。與水平方向成角約60°。垂直進(jìn)針,至針尖達(dá)軟骨終板側(cè)椎體中心;側(cè)位透視顯示針尖位于椎體前2/5與后3/5交界處。以DSA的X線CT穿刺(XperCT)定位功能確認(rèn)針尖位置。將優(yōu)維顯-300稀釋50%,推注1 mL行椎體造影,1 mL生理鹽水沖洗針道后靜息3 min。實(shí)驗(yàn)組注射平陽(yáng)霉素(2 mg/mL) 1 mL,對(duì)照組注射生理鹽水1 mL。每次注射持續(xù)5 min。拔刺針后按壓穿刺點(diǎn)2 min局部消毒包扎。術(shù)后3 d,每只兔每天肌注4萬(wàn)單位慶大霉素。
1.3 MRI檢查
術(shù)后第1。2。3。4。5周及第3月隨機(jī)選取6只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行MRI檢查,使用Simens 3.0T Magnetom TrioTim MR儀掃描;分別行兔脊柱矢狀位的脂肪抑制T1WI(Fat Saturation T1WI,FST1WI)。T2WI及脂肪抑制T2WI(Fat Saturation T2WI,FST2WI);掃描參數(shù)為:T1WI:TE 12 ms,TR 540 ms,視野(FOV) 200 mm,層厚2 ~ 3 mm;T2WI:TE 100 ms,TR 1 900 ms;測(cè)量術(shù)后第4周椎體矢狀位高信號(hào)區(qū)面積(長(zhǎng) × 寬,單位:mm2),每個(gè)椎體測(cè)量四個(gè)層面(n = 6 × 4)。
1.4 病理學(xué)檢查
每次MRI檢查后將兔處死,透視下取出L4。L5椎體,大體觀察標(biāo)本顏色。周圍軟組織反應(yīng)情況等。標(biāo)本取與椎體矢狀面呈30°剖面,40 g/L多聚甲醛固定一周后,Plank-Rycholo液脫鈣5 ~ 7 d,石蠟包埋。切片及再固定,系列酒精脫水,石臘包埋,5 μm組織切片。HE染色。低倍鏡下觀察腰椎椎體。軟骨終板及椎間盤變化,中倍及高倍鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu),將術(shù)后第4周興趣區(qū)標(biāo)本切片4份(n = 6 × 4);高倍視野下計(jì)算每張切片中腰椎椎體病變區(qū)面積(長(zhǎng) × 寬,單位:mm2)。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
實(shí)驗(yàn)組第4周T2WI高信號(hào)區(qū)面積(ST2WI)與病理切片病變區(qū)面積(Shistology)的相關(guān)性采用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。
2 結(jié) 果
穿刺過(guò)程順利,注射平陽(yáng)霉素前的椎體造影可顯示椎體的微血管及引流靜脈(圖1,2);術(shù)后所有兔均存活,無(wú)截癱及感染等。對(duì)照組MRI及病理學(xué)檢查均無(wú)明顯變化。實(shí)驗(yàn)組MRI及病理第1 ~ 2周變化不明顯,第3周MRI出現(xiàn)FST1WI低信號(hào),T2WI及FST2WI呈稍高信號(hào),第4周信號(hào)變化更明顯(圖3);第3 ~ 4周病理,骨小梁排列雜亂。骨細(xì)胞逐漸減少,骨髓內(nèi)血細(xì)胞減少。脂肪細(xì)胞增多融合,軟骨終板細(xì)胞減少。結(jié)構(gòu)紊亂,纖維環(huán)及髓核無(wú)明顯變化,第5周病理出現(xiàn)軟骨終板和椎間盤退變表現(xiàn):軟骨終板細(xì)胞壞死,髓核及纖維環(huán)結(jié)構(gòu)破壞(圖4)。第3月軟骨終板側(cè)椎體缺血持續(xù)存在,軟骨終板和椎間盤退變更為明顯(圖5)。實(shí)驗(yàn)組第4周T2WI高信號(hào)區(qū)面積(ST2WI)與病理切片病變區(qū)面積(Shistology)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示,兩者間存在明顯的正相關(guān)性(r = 0.965,P < 0.001;表1)。
3 討 論
椎間盤退變是腰腿痛和下腰痛的重要原因之一,也是腰椎間盤突出癥和其他腰椎疾患的病理基礎(chǔ)[11]。椎間盤退變實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可為退變椎間盤的修復(fù)研究提供良好的實(shí)驗(yàn)載體。椎間盤退變實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為兩大類:誘發(fā)性和自發(fā)性。其中以鼠。兔及犬制作的誘發(fā)性模型應(yīng)用最為廣泛,包括通過(guò)改變椎間盤生物力學(xué)環(huán)境。損傷椎間盤自身結(jié)構(gòu)以及應(yīng)用基因技術(shù)改變動(dòng)物的遺傳性狀等誘發(fā)退變。這些方法均為外界人為因素直接作用于椎間盤本身。創(chuàng)傷較大。本研究采用經(jīng)皮穿刺兔腰椎終板側(cè)椎體,注射去血管化平陽(yáng)霉素造成椎體微循環(huán)的破壞,形成軟骨終板側(cè)椎體缺血,進(jìn)而引起腰椎終板及椎間盤的退變,具有操作簡(jiǎn)便。創(chuàng)傷小及不直接損傷椎間盤結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn)醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站payment-defi.com。
平陽(yáng)霉素作用是干擾血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝,抑制細(xì)胞內(nèi)的DNA合成。造成內(nèi)皮細(xì)胞變性和增生,最終血栓形成從而引起血管供血部位的缺血[12]。本實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組注射平陽(yáng)霉素,第3周病理顯示骨小梁排列雜亂, 骨細(xì)胞逐漸減少;骨髓內(nèi)血細(xì)胞減少,脂肪細(xì)胞增多。融合;軟骨終板內(nèi)細(xì)胞減少。結(jié)構(gòu)紊亂。而纖維環(huán)及髓核無(wú)明顯變化。第4周時(shí)上述病理變化更加明顯,但無(wú)椎間盤退變表現(xiàn)。與同期的對(duì)照組比較,可排除穿刺本身對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物影響的可能。第1周和第2周的陰性結(jié)果提示,藥物沒(méi)有直接作用于軟骨終板和椎間盤。術(shù)后前4周,平陽(yáng)霉素造成軟骨終板側(cè)椎體微血管及血竇內(nèi)皮細(xì)胞的逐漸損傷,進(jìn)而影響骨細(xì)胞及軟骨終板細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供給及代謝,腰椎終板逐漸發(fā)生退變。第5周椎間盤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)障礙加重,椎間盤退變開(kāi)始出現(xiàn);術(shù)后第3月,軟骨終板側(cè)椎體缺血改變持續(xù)存在,腰椎終板及椎間盤退變更為典型。這表明軟骨終板側(cè)椎體缺血對(duì)終板及椎間盤退變有著直接的作用。
