醫(yī)學免費論文:快速篩選調節(jié)肝脂酶活性中藥成分方法的研究

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

FTZ提取物 稱取FTZ處方藥材(由女貞子、丹參、三七、黃連等按2∶1∶0.5∶0.5質量比組成)，置圓底燒瓶中，加70%(φ)乙醇8倍量，浸泡0.5 h，加熱回流提取1.5 h，濾過，濾液減壓回收乙醇并濃縮，濃縮液備用;藥渣加水8倍量，加熱回流提取1.5 h，濾過，濃縮，合并濃縮至3 g生藥/g浸膏,臨用時用0.1 mmol/L Tris�睠l緩沖液溶解稀釋至相應濃度。

三七總皂苷、人參皂苷Rb2、齊墩果酸、鹽酸小檗堿、丹參素由中國藥品生物制品檢定所提供;總脂酶試劑盒(南京建成生物工程研究所);大鼠肝脂酶的ELISA測定試劑盒(武漢中美科技);磷酸鹽等試劑均為國產分析純試劑; 鹽酸氯丙嗪(Sigma公司);十二烷基硫酸鈉(SDS)、二硫代蘇糖醇(DTT)(Amresco)。

1.2 實驗動物

Spague Dawley(SD)大鼠,由廣東省實驗動物中心提供，雄性，體質量200～250 g，符合SPF級標準，合格證號：檢證字2009A056醫(yī).學全.在.線網站payment-defi.com。

1.3 主要儀器

SPECORD S600分光光度計(德國耶拿)、BIO�睺EK Elx��800酶標儀(美國BIO�睺EC)、HC��3018R離心機(科大創(chuàng)新)、高速冷凍離心機(EPPENDORF)、高速勻漿機(IKA)。

2 方 法

2.1 大鼠肝臟勻漿制備及HL含量測定

取健康雄性大鼠，禁食一晚，乙醚麻醉后斷頭處死大鼠，迅速取出肝臟,在冰浴上剪成碎塊，用4 ℃預冷的生理鹽水洗去血液，用4 ℃預冷的0.1 mol/L Tris�睭Cl( pH=9.5)在冰水浴中制成10%(1 g/10 mL)的勻漿,組織勻漿至顯微鏡下無完好細胞，低溫下8 000 r/min離心5 min，取脂層下清液，加入DTT至1 mmol/L，保存于-70 ℃冰箱中備用。Bradford法測定肝勻漿中蛋白質含量,用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法測定勻漿中HL酶蛋白含量。

2.2 肝組織勻漿中HL活力的比色測定方法

HL活性測定是以脂肪乳劑為底物,在37 ℃、pH 9.5 條件下與一定量的肝勻漿37 ℃水浴保溫30 min，肝勻漿中的HL可將底物中的TG 水解為甘油和游離脂肪酸(free fatty acid,FFA),用有機溶劑二次提取FFA，銅試劑比色法測定生成的FFA 含量,計算反應體系肝勻漿中肝脂酶的比活性[1 U=1 μmol/L FFA/(h·mg)，即每毫克勻漿蛋白每小時在反應系統(tǒng)中催化生成1 μmol/L的FFA定義為1個酶活性單位][8，9]。

三酰甘油乳劑：0.82 mL三油酸甘油酯，1 g阿拉伯膠，1.5 g白蛋白加含1 mol/L NaCl、 0.005 mol/L Ca2+的0.1 mol/L pH9.5 Tris�睭Cl緩沖液至100 mL，制成乳劑。

酶活力測定反應體系總體積為1 mL，包括0.1 mol/L Tris�睭Cl 0.74 mL (pH=9.5，Ca2+5 mmol/L)，20% BSA 0.1 mL,脂肪乳劑10 μL,10 mol/L NaCl 0.l mL,肝組織勻漿上清液50 μL。

2.3 大鼠肝勻漿HL酶活性測定條件的優(yōu)化

2.3.1 勻漿量對大鼠肝HL活性的影響 配制pH值9.5的Tris�睭C1系統(tǒng)，加入相關的試劑，分別加入5、10.0、20.0、30.0、50.0 μg/mL的肝勻漿，按上述方法操作，測定加入不同肝勻漿量的HL活性，確定測定肝勻漿中HL活性的最佳勻漿量。

2.3.2 反應體系pH對大鼠肝HL活性的影響 配制不同pH值的Tris�睭C1系統(tǒng)，加入50 μL的肝勻漿和相同量的相關試劑，按上述方法操作測定不同pH值(7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)的Tris�睭Cl反應系統(tǒng)中肝勻漿的HL活性，確定測定肝勻漿中HL活性的最佳pH條件。

2.3.3 溫度和DTT對酶活性影響 收集肝組織勻漿后立即測定肝脂酶活性,然后分別測定25 ℃、4 ℃、-20 ℃、-70 ℃下保存24 h的肝脂酶活性，并測定加終濃度為1 mmol/L的DTT 肝組織勻漿在 4 ℃、-20 ℃，-70 ℃保存24 h、30 d時的HL活性。

2.3.4 反應時間對肝勻漿HL活性的影響 在pH9.5的Tris�睠l反應體系中，分別加入50 μL 肝勻漿，37 ℃分別溫育0、10、30、60、90、120 min，測定HL活性，確定肝勻漿中HL活性與反應時間的關系。

2.3.5 激活劑鈣濃度對肝勻漿中HL活性的影響 在pH9.5的的Tris�睠l反應體系中，分別加入不同量的1 mol/L EGTA溶液，使體系中游離鈣濃度(Ca2+)分別為0.001、0.005、0.025、0.10 mol/L,然后分別加入50 μL的肝勻漿，按上述方法操作測定不同pH鈣濃度下系統(tǒng)中肝勻漿的HL活性，確定鈣濃度對肝勻漿中HL活性的影響。

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