| 公開(公告)號 | CN1296479C |
| 公開(公告)日 | 2007.01.24 |
| 申請(專利)號 | CN200510044143.3 |
| 申請日期 | 2005.07.27 |
| 專利名稱 | 一種人角膜內(nèi)皮細胞系的構(gòu)建方法 |
| 主分類號 | C12N5/08(2006.01)I |
| 分類號 | C12N5/08(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 中國海洋大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 樊廷俊;付永鋒;叢日山;湯志宏;孫文杰;于秋濤;王 晶;趙 君 |
| 地址 | 266003山東省青島市市南區(qū)魚山路5號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構(gòu) | 青島海昊知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所有限公司 |
| 代理人 | 張中南 |
| 國省代碼 | 山東;37 |
| 主權(quán)項 | 一種人角膜內(nèi)皮細胞系的構(gòu)建方法，首先從眼庫中取出人角膜，分別用氯化汞溶液和慶大霉素消毒后置于超凈工作臺中，將角膜的凹面朝上平放于玻璃培養(yǎng)皿中，向凹陷區(qū)加入0.2～0.5％胰蛋白酶溶液0.5～1毫升消化3～6分鐘后；再把角膜平均剪成4片，按內(nèi)皮面朝下的方向貼入24孔培養(yǎng)板的孔底，加入含有20％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，置于5％二氧化碳培養(yǎng)箱中、37℃進行貼板培養(yǎng)，并以時間梯度連續(xù)揭膜的培養(yǎng)方法將獲得的人角膜內(nèi)皮細胞，上述時間梯度連續(xù)揭膜的培養(yǎng)方法是將角膜片培養(yǎng)24～48小時后，取出角膜片轉(zhuǎn)貼于另一新培養(yǎng)孔中，加入同樣培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；于培養(yǎng)箱中12～24小時后，取出角膜片再轉(zhuǎn)貼于另一新培養(yǎng)孔中，再加入同樣培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；6～12小時后，取出角膜片，于倒置光學(xué)顯微鏡下挑選出只含有人角膜內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)孔中的角膜內(nèi)皮細胞，于培養(yǎng)箱中放置12～24小時后，在每個培養(yǎng)孔中加入1毫升的人角膜內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)液——DMEM/F12培養(yǎng)液，20％胎牛血清，0.25‰～1‰硫酸軟骨素，0.05‰～0.15‰羧甲基殼多糖，然后置5％二氧化碳培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)；每間隔3～5天更換人角膜內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)液1次，待人角膜內(nèi)皮細胞長成單層后，用0.2～0.5％胰蛋白酶溶液消化制成細胞懸液，按1瓶傳2瓶的方式進行傳代培養(yǎng)；待人角膜內(nèi)皮細胞再次長成單層后，仍以相同方法進行傳代。 |
| 摘要 | 一種人角膜內(nèi)皮細胞系的構(gòu)建方法，它是以角膜內(nèi)皮為材料，先將角膜內(nèi)皮面朝下進行貼板培養(yǎng)，采用時間梯度連續(xù)貼膜法獲得純凈角膜內(nèi)皮細胞，在含20％胎牛血清、硫酸軟骨素氧化降解物、表皮細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、牛眼生素的DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)；采用胰蛋白酶消化法進行傳代培養(yǎng)。該技術(shù)工藝科學(xué)合理，經(jīng)這種方法所獲得的傳代細胞目前已傳至第106代。本發(fā)明的角膜內(nèi)皮細胞未經(jīng)任何病毒或癌基因轉(zhuǎn)染，因此獲得的人角膜內(nèi)皮細胞沒有任何致瘤性，可望直接用于人工角膜生產(chǎn)和臨床應(yīng)用。 |
| 國際公布 |
